KLONOVÁNÍ GENŮ





n      multi-krokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA pomocí
restrikčních endonukleáz



n      spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se  speciálním nosičem -- vektor
pomocí T4 DNA ligázy



n      přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často bakterie)



n      mnohonásobné namnožení vložených DNA fragmentů replikaci

    v živé  buňce -- DNA KLONY







n        vytváření geneticky identických buněk (organismů)

n         v živé přírodě přirozené:

                                - kolonie bakterii

           - řízkování rostlin

           - jednovaječná dvojčata                



                                         KLONOVACÍ VEKTORY

A)      Bakteriální -- PLAZMIDY

            -  extrachromosomální kružnicové molekuly DNA, které se nachází v celé řadě

                 bakteriálních druhů (rezistence k antibiotikům, metabolismus nezvyklých  

                 substrátu...) 1-100kb

             -   replikují se nezávisle na bakterii

             -   vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených

                                         KLONOVACÍ VEKTORY

  --    Virové  - BAKTERIOFÁGY

          - bakteriální viry s dvouřetězcovou lineární DNA

           - schopny se v hostitelské buňce replikovat, aniž 

            by ji zahubily

           -  klonovací kapacita 2-25kb inzertu

           -  mnohonásobné množení v závislosti na hostitelské bakterii  

                                         KLONOVACÍ VEKTORY

  *     odvozené z plasmidu do kterého byly naklonovány cos místa bakteriofága l

  *     Inzertová DNA je naklonována do lineárního kosmidu a sbalena in vitro virovým mechanismem a
  infikována do bakterie

  *     v bakterii je pak cirkulována a replikuje se dál jako plasmid

  *     malá velikost cca 5kb -- není potřeba infekčních lytických l proteinů, pouze      selekční
  marker k antibiotiku může se velikost inzertové DNA pohybovat až k 47kb

  



n      odvozené od bakteriofága M13 s malou ssDNA (6.4kb), který se po infekci do bakterie replikuje
jako kruhovitá dsDNA (plasmid, snadná manipulace, restrikce)

n      infekční fágové částice však opět obsahují pouze ssDNA (vhodný zdroj pro izolaci ssDNA např.
pro hybridizaci)

n      do infekčních častic mohou být sbaleny částice až dvakrát větší než je fágová DNA



                               Obecný princip molekulárního klonování

klonovací vector + DNA obsahující požadovaný gen (izolace)



                                    restrikce





                                    ligace







                        transformace



selekce pomocí selekčních markerů





reprodukce a syntéza cílového proteinu

izolace

                                 Základní kroky při klonování genů:

*               štěpení DNA na požadovaných místech

*               rekombinace - spojení DNA-fragmentů

*               transformace -- vpravení rekombinované DNA do buňky

*               selekce buněk obsahující cizí gen

*               analýza klonované DNA

                          -  při genových manipulacích je žádoucí molekulu DNA 
                                             štěpit      
                      na přesně definovaných místech tak, aby byl tento proces  
                                           reprodukovatelný
                    -  štěpení se provádí pomocí restrikčních enzymů -- enzymy,  
                       které bakterie používají jako obranný systém při napadení
                                                 fágy.
                         Tyto enzymy štěpí DNA na přesně definovaných místech 
                        daných specifickou sekvencí bází. Takových enzymů bylo 
                                        objeveno již celá řada.











                                  Využití molekulárního klonování

n      uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny)

n      produkce proteinů pro různorodé využití

n      vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)





                                       Děkujeme za pozornost