SEKVENOVÁNÍ DNA



*      Jedna z metod studia genů

*      Využití v aplikovaných oblastech molekulární biologie -- např. medicíně při diagnostice
genetických chorob



                           SEKVENOVÁNÍ DNA = stanovení pořadí nukleotidů



*      Sekvenují se úseky délky několika set nukleotidů

*      Delší úseky nutno rozdělit na kratší

*      Překrývající se fragmenty a získané fragmenty se sekvenují odděleně.

                                     Dvě metody sekvenování DNA

*      Sekvenování DNA dle Sangera (dideoxynukleotidová terminační metoda)



*      Chemická metoda sekvenování DNA dle Maxama a Gilberta

                                       dideoxyribonukleotidy

*      Na 2. a 3. Uhlíku pentosového zbytku nemají --OH skupinu

*      Nemůže se k nim připojit žádný další nukliotid

*      ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP

                                    Sekvenování DNA dle Sangera

                                               1.KROK

*      "Přihybridizování" sekvenčního primeru (počáteční krátká sekvence nukleotidů) k jednovláknové
DNA, jejíž sekvence má být stanovena





*      Sangerova metoda je založena na schopnosti DNA-polymerasy syntetizovat druhé vlákno DNA
začínající od 3'-konce primeru







*      Enzymy připojí nový nukleotid k --OH skupině na 3. uhlíku deoxyribosy





*      Jestliže je pro syntézu použit abnormální 2,3-dideoxyribonukleotid (např. ddCTP) místo
"normálního" nukleotidu (2-deoxy),  syntéza nemůže pokračovat









                                           Z toho plyne:

*      pokud jsou ve vláknu zabudované "normální" deoxyribonukleotidy, syntéza probíhá

*      Objeví-li se zabudovaná dideribonukleotid, syntéza je ukončena



                                              2. KROK

*      Prodlužování primerů připojováním nukleotidů DNA polymerazou (dle komplementarity bází
zkoumané DNA)

*      Na místo deoxyribonukleotidu se do řetezce může včlenit jeho dideoxyribonukleotidlvý analog =
polymerizace komplementárního vlákna je ukončena

*      Vznikají různě dlouhé úseky sekvenovaných molekul DNA VŽDY končících příslušným
dideoxyribonulkeotidem

Vždy se provádějí 4 sekvenační reakce současně, do každého ze 4 vzorků je přidán jiný didenukleotid

TCAGACTATTGAC

AGTCTGATA ATCGCTAACTGACCTGCACGTAAGCTGC



TCAGACTATTAGCGATTGAC

AGTCTGATA ATCGCTAACTGACCTGCACGTAAGCTGC



TCAGACTATTAGCGATTGACTGGAC

AGTCTGATA ATCGCTAACTGACCTGCACGTAAGCTGC



TCAGACTAT TAGCGATTGACTGGACGTCC

AGTCTGATA ATCGCTAACTGACCTGCACGTAAGCTGC







*      Reakce probíhají v samostatných zkumavkách, výsledné směsy jsou nanášeny na gel a
elektroforeticky rozděleny podle délky

      Pro usnadnění detekce fragmentů se používají k syntéze DNA nulkeotidy radioaktivně nebo
                                       fluorescenčně značené

                       Chemická metoda sekvenování DNA dle Maxama a Gilberta

*      DNA na jednom konci radioaktivně označena, chemicky štěpena činidly -- specificky přeruší DNA
řetězec v sousedství určitého nukleotidu

*      Vzniká směs různě dlouhých štěpů

*      4 reakce probíhají souběžně

*      Produkty se rozdělí elektroforeticky, radioaktivita proužků se detekuje pomocí
autoradiografie