Restrikční mapování

                              Ildikó Németh, Marek Motola, Tomáš Merta

                                    Co je to restrikční štěpení?

*      Rozštěpení DNA ve specifických restrikčních místech pomocí ENDONUKLEÁZ (restričních enzymů)

                                      Restrikční endonukleázy

*       Jsou enzymy bakteriálního původu

*       Endonukleáza je enzym  štěpící  nukleovou  kyselinu uvnitř řetězce na více kratších
fragmentů

*       Restrikční  endonukleáza   neštěpí  DNA  kdekoliv,  ale rozpoznává specifickou
dvouřetězcovou  sekvenci bazí v molekule DNA

*       Většina restrikčních enzymů má rozpoznávací místa, která se skládají ze čtyř nebo šesti párů
bazí

*       Při změně jediné báze dojde ke zrušení cílového místa a DNA zde tedy nebude štěpena

*       Restrikčních endonukleáz je známo několik tisíc





 např. Eco R1 -- restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC



*      Štěpení vzorku genomové DNA enzymem EcoRI vytvoří soubor přibližně jednoho milionu fragmentů,
z nichž každý má svůj konkrétní lokus v genomu

*      Specifickou sekvenci tedy můžeme vyšetřit přibližně  u jednoho milionu míst v genomu







                                              Vektory

*       Deriváty virových chromosomů a plasmidů

*       Vystřihnutá nukleotidová sekvence se vkládá do vektoru za účelem její replikace

*       Plazmidový vektor-dvouřetězcová molekula DNA od 1kb do 200kb

*       Obsahují pouze jedno restrikční místo pro danou endonukleázu

                                          Restrikčné mapy

*      Při použití více endonulkeáz zostříháme molekulu DNA na kratší fragmenty  -  jejich délka
10^2  - 10^3 bází

*      Vzniklé fragmenty je možno rozdělit podle jejich délky gelovou elektroforézou

*      Nejkratší úseky dojedou nejdál











                                  Při mutaci na restrikčním místě

*      Endonukleáza nenalezne restrikční místo tudíž nemůže DNA v daném místě rozštěpit

*      Vzniklé fragmenty mají jiné délky než fragmenty DNA která nepodlehla mutaci

*      Porovnáním těchto fragmentů lze zjistit případné mutace

                                              Využití

*       Jeden z prvních kroků při charakterizaci DNA o neznámé sekvenci

*       Využití v lékařské genetice v technologii rekombinantní DNA

*       Vyšetření specifické sekvence nukleotidů v rámci restrikčních míst pro danou endonukleázu  v
genomu

*       Tvorba rekombinantní molekuly DNA, jejíž jeden konec pochází z jednoho a druhý konec z
druhého zdroje DNA (např.výroba lidského inzulinu in vitro)