Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 18: Přehled anaerobů a mykobakterií Co nás dnes čeká § Nesporulující anaerobní bakterie § Klostridia (grampozitivní sporulující anaerobní tyčinky) § Mykobakteria (původce tuberkulózy, původce lepry, atypická mykobakteria); zmínka o aktinomycetách a nokardiích Ještě než začneme… § …měli bychom si cosi uvědomit. Doteď (minulé dvě přednášky) jsme si povídali většinou (až na výjimky, např, kapavku) o bakteriích, které se projeví při běžné diagnostice § Doktor prostě pošle vzorek „na kultivaci“, a ono z něj „něco vyroste“. § S tím už je ale KONEC! Dál už nás čekají jen mikroby, pro které tohle neplatí. Takže: § Pokud chce klinik, aby byl jeho vzorek prověřen na přítomnost anaerobů, mykobakterií či aktinomycet, musí to uvést na průvodce. Musí se užít speciální postupy. § U dalších původců (třeba spirochet či chlamydií) se navíc zpravidla odebírá sérum a provádí se nepřímý průkaz § Laborant si toho musí být vědom a případně upozornit na vhodný způsob odběru či označení průvodky 1. Nesporulující anaeroby Co jsme znali doteď Nyní si přidáme další čtyři skupiny Příběh § Paní Raková byla přijata pro horečnatý stav a intenzivní bolesti břicha § Zobrazovací metody ukázaly na absces malé pánve. Ukázaly však také nádor na děložním čípku – později se ukázalo že jde o karcinom § U paní Rakové se naštěstí podařilo operačně vyřešit nejdříve absces a poté i nádor, byť za cenu provedení hysterektomie. Metastázy se naštěstí neobjevily. Viníkem je Připomeňme si, za jakých podmínek rostou jaké bakterie Společné charakteristiky nesporulujících anaerobů Rozdíly mezi gramnegativními anaerobními tyčinkami 2. Klostridia Úvod: Mikulecké pole trochu jinak Mikulecké pole hluboko zorané Nejedno Clostridium tetani v tom poli je schované V poli je schované zalezlé ve spoře Čeká až syneček nějaký to pole zas pooře… Klostridia – přehled Příběh první § Mustafa, kosovský Albánec, se rozhodl, že navštíví svého bratrance v sousední vesnici. Pole, přes které se vydal, již mělo být odminováno. Přesto se jedna nevybuchlá mina ještě našla. Střepina, špinavá od bláta, se Mustafovi zasekla hluboko do stehna. § Za několik dní byl Mustafa přijat do jedné z.polních nemocnic. Stehno měl zduřelé a při poklepu byl slyšitelný zvuk praskajících bublinek. Mustafa byl hned operován. Viníkem je tentokrát § Clostridium perfringens, jeden z původců plynaté sněti (spolu s C. novyi, C. septicum aj.) § Plynatá sněť je typické válečné onemocnění. Může se však vyskytnout i v dobách míru, například při živelných pohromách § Klostridia plynatých snětí – respektive jejich enterotoxiny – se také uplatňují jako patogeny ve střevě Vznik plynaté sněti Nekrotizující enterokolitida – i to může způsobovat C. perfringens Příběh druhý § Pan Kostečka ležel už třetí týden v nemocnici pro bakteriální zánět kostní dřeně. Zánět mu léčili klindamycinem, linkosamidovým antibiotikem. Náhle pan Kostečka dostal těžký průjem. Na oddělení zrovna neměli metronidazol, a tak sáhli po staré metodě: dali panu Kostečkovi vypít ampulku vankomycinu, antibiotika, které se normálně podává pouze injekčně, protože se nevstřebává ze střeva. Viníkem je Tetanus Ještě jednou tetanus Trismus (křeč čelistních svalů) Botulismus Typický vzhled jazyka při botulismu Defilé zločinců: C. botulinum (vlevo), C. septicum (vpravo) Diagnostika anaerobů (společná část k nesporulujícím i klostridiím) § Mikroskopie: Má větší význam než u aerobů, vzhledem k morfologické různorodosti § Kultivace: Je nutno zajistit anaerobiózu pomocí anaerostatů či anaerobních boxů. U tekutých půd postačuje přelití parafinem. Používá se VL (viande levure) bujón, VL krevní agar a různé speciální půdy § Biochemie: kataláza a oxidáza většinou negativní, možné vzájemné rozlišení biochemicky, i analýza plynů chromatogafií (jsou biochemicky aktivní) § Antigenní analýza a nepřímý průkaz se v diagnostice anaerobů příliš nepoužívají Diagnostika anaerobů – pokračování § Pokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu. U tetanu se myš svíjí v křeči (typické jsou napnuté končetiny a napružený ocas), u botulismu je naopak patrné ochabnutí končetin a celého těla. Opistotonus § Opistotonus znamená esovité prohnutí těla, případně i ocasu, jaké pozorujeme u pokusné myši K mikroskopii anaerobů § Studenti někdy zaměňují spóru (útvar, který je neprobarvený, resp. jen slabě se rýsují jeho okraje) a ztluštění tyčinky (které se vyskytuje u některých tyčinek, které jsou nesporulující a zpravidla gramnegativní). § U skutečných sporulujících mikrobů má význam sledovat umístění spór. U Clostridium tetani je spóra terminální (na konci umístěná) § Anaerobní tyčinky jsou někdy velice různotvaré – v.jednom preparátu najdete útvary od vláknitých až po prakticky kokovité Bacteroides Poznámka ke kultivaci anaerobů: Jak získat anaerobiózu § Mechanicky – VL bujony přelijeme parafinovým olejem § Fyzikálně – v anaerobním boxu se nahradí vzduch směsí anaerobních plynů, vháněných z bomby § Chemicky – v anaerostatu se [§ ] z organických kyselin tvoří vodík a CO[2 ]§ v druhé fázi na palladiovém katalyzátoru reaguje vodík s kyslíkem za vzniku vody, takže se kyslík spotřebovává Přelévání VL-bujonů parafinem Anaerobní box Anaerostat Anaerostat podrobnější popis Anaerostat jiné provenience Ještě ke kultivaci § Anaerobní bakterie rostou často v drobných, nepravidelných koloniích, které mají někdy výběžkaté okraje. Typický je pro ně také značný zápach. Biochemické rozlišení § Používají se různé testy, v našich podmínkách především ANAEROtest 23 Lachema. Anaerotest - příklad odečítání Ukázky různých zahraničních testů pro identifikaci anaerobů Testy antibiotické citlivosti § Antibiotická citlivost se u anaerobů určuje na půdách, na kterých jsou schopny růst, tj. nikoli na MH agaru, ale zpravidla na VL krevním agaru § Lékem volby u většiny anaerobů je opět klasický penicilin. Rezistentní je však rod Bacteroides (v užším slova smyslu – rody Prevotella a Porphyromonas, které se z něj kdysi odštěpily, jsou citlivé) Typické citlivosti § Typické je, že mnohé anaeroby jsou rezistentní na vankomycin. Zároveň jsou přitom citlivé na „slabší“ antibiotika, jako je penicilin či metronidazol (na snímku) Ilustrační foto Průkaz tvorby lecitinázy – specialita v diagnostice C. perfringens 3. Mykobakteria, aktinomycety, nokardie Úvod: Plivátka v boji proti TBC V době první republiky vyvinula společnost za osobní angažovanosti prezidenta Masaryka a jeho „Ligy proti tuberkulóze“ velké úsilí v boji proti této nemoci. Významnou součástí byla osvěta, aby lidé neplivali na zem, ale používali plivátka. Příběh první § Honza již několik let věděl, že je HIV pozitivní. Dobře věděl, že je mnohem zranitelnější než ostatní lidé, že ho každá infekce dostihne rychleji než jiné § Přesto ho zaskočilo, že v.poslední době začal kašlat. Jeho ošetřující lékaři zkoušeli různé možnosti, až nakonec na základě rentgenu, PCR vyšetření a kultivačního vyšetření dospěli k.názoru, že se jedná o miliární (zrnkovitou) formu tuberkulózy. Viníkem zde bylo § Mycobacterium tuberculosis, i když TBC může zůpsobovat i například Mycobacterium bovis. § Zajímavostí tohoto mikroba je záliba v životě uvnitř buněk. S tím také souvisí skutečnost, že na mykobakteria se špatně tvoří protilátková odpověď (takže se nedá prokazovat antigen ani protilátky) a že hlavní slovo má buněčná imunita – i při vakcinaci. § Jelikož při HIV infekci je právě buněčná imunita postižena, je TBC jednou z oportunních infekcí. Tuberkulóza Není jen plicní forma TBC TBC ve světě Ještě jednou TBC Další zvláštnosti mykobakterií Buněčná stěna mykobakterií Příběh druhý § Pan Hassan žil v pouštní části Súdánu, zmítané neustálými válkami a nepokoji. § V poslední době se od něj začali odvracet i ti přátelé, kteří ještě neuprchli ani nebyli povražděni. Znetvoření obličeje pana Hassana bylo neklamnou známkou, že pan Hassan trpí onemocněním, které se v těchto zeměpisných šířkách ještě stále vyskytuje až příliš často. § Naštěstí se pan Hassan setkal s pracovníky jedné nevládní organizace, kterým rovněž byla diagnóza jasná. Pomocí dapsonu se podařilo panu Hassanovi pomoci. Viníkem je Lepra Jiná mykobakteria § Kromě M. tuberculosis a M. leprae existuje i spousta dalších mykobakterií. Některá, např. Mycobacterium marinum, patří mezi tzv. atypická mykobakteria, která občas způsobují infekce ran a jiné problémy. Některá mykobakteria jsou nepatogenní a jsou normální součástí lidské mikroflóry, např. M. smegmatis – viz obrázek Příběh třetí § Paní Píštělková si už delší dobu hmatala pod kůží krku drobné útvary § Nedávno se stalo, že jeden z těchto útvarů se otevřel na povrch a v ústí se objevil velmi hustý, žlutý páchnoucí hnis. To už paní Píštělkovou donutilo zajít k lékaři. § Lékaři poslali hnis na mikrobiologické vyšetření. Vyšetření trvalo dlouho – paní Píštělková už spílala mikrobiologům, že si tam někde válejí šunky. Nakonec se ukázalo, že… …jde o aktinomykózu Nokardióza mozku na CT Acidorezistence a alkalirezistence Co z toho vyplývá pro klinika? Defilé zločinců: Mycobacterium tuberculosis Jak pátrat mykobakteriích § Mikroskopie: Používá se Ziehl-Neelsenovo barvení § Kultivace: Používá se speciálních půd, přičemž před vlastní kultivací předchází moření, obvykle louhem. Cílem moření je usmrtit ostatní bakterie, které by při svém rychlém růstu byly kultivačně úspěšnější. Alkalirezistentní mykobakteria moření ruče přežijí. § Automatická kultivace: Používá se různých typů kultivačních automatů: mohou detekovat kultivační pozitivitu mnohem dříve než klasická kultivace § Biochemické rozlišení je možné, je však vyhrazeno specializovaným laboratořím § Pokus na zvířeti: občas se používá morče § PCR diagnostika se stává čím dál důležitější PCR kit pro diagnostiku TBC Barvení dle Ziehl-Neelsena § V prvním kroku barvíme karbolfuchsinem (Gabbetem) za horka až do výstupu par. Bez zahřívání by mykobakteria vůbec nešlo obarvit. § V druhém kroku odbarvujeme „kyselým alkoholem“, což je směs alkoholu s minerální kyselinou, nejčastěji kyselinou chlorovodíkovou § Ve třetím kroku dobarvujeme pozadí, tj. vše, co jsme ve druhém kroku odbarvili. Dobarvujeme malachitovou zelení nebo metylenovou modří. § Výsledkem jsou červené acidorezistentní tyčinky na modrém nebo zeleném pozadí Ziehl-Neelsenovo barvení Kultivace mykobakterií § Před kultivací musí být provedeno moření § Používáme tekutou půdu Šulovu či Baničovu a vaječné půdy Ogawovu či Löwenstein-Jenssenovu. Vaječné půdy jsou tuhé vzhledem ke koagulaci vaječného bílku – neobsahují agar § I pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají zátkou. Není to jen kvůli ohrožení personálu, ale především kvůli vyschnutí půdy. § Výsledky se odečítají po 3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace. Vzhled kolonií mykobakterií K tekuté Šulově půdě § I pozitivní zkumavka je na první pohled čirá, protože nárůst mykobakterií je patrný jen u dna („modrej bordel“, jak to trefně označila studentka J. H. J) Testy antituberkulotické citlivosti (nikoli antibiotické!) § Nelze používat difúzní diskové testy § Antituberkulotika přidáváme přímo do kultivační půdy § Antituberkulotika jsou zvláštní látky, až na výjimky odlišné od antibiotik § Vždy se užívají kombinace tří či čtyř: rychle totiž vznikají rezistence, navíc některá působí jen intra- a jiná zase extracelulárně Přehled běžně užívaných antituberkulotik Diagnostika nokardií a aktinomycet § Jsou jen částečně acidorezistentní. Barví se i podle Grama, ale poměrně špatně. Jsou to grampozitivní až gramplabilní vlákna § Nokardie jsou aerobní, aktinomycety anaerobní Testy antibiotické citlivosti § Antibiotická citlivost se na rozdíl od mykobakterií dá u nokardií a aktinomycet stanovit difusním diskovým testem. Musíme ale počítat s tím, že rostou pomalu a špatně. Děkuji za pozornost