DNA knihovny









   26.4.07                                                 Vítězslav Kříž, Biologický ústav LF MU

                                      Co to jsou DNA knihovny

                                    Proč se tvoří DNA knihovny?

                                Co je třeba na tvorbu DNA knihovny?

•      Enzymy:

        »   Restrikční endonukleáza

        »   DNA Ligáza



•      Analyzovaná DNA

•      Vektor

•      Buňka umožňující namnožení klonované DNA

        »    bakterie, kvasinka









•      Restrikční endonukleázy (restriktázy )



      –   Enzymy které štěpí fosfodiesterové vazby v dsDNA

      –   Každý enzym rozeznává specifickou palindromatikou sekvenci ve které štěpí

      -Příklad EcoRI rozeznává tuto sekvenci: 5'-GAATTC-3

          štěpí tímto způsobem:                  5'---G         AATTC---3'

                              3'---CTTAA         G---5'



                                              Plasmid





                                  BAC: Umělý bakteriální chromozóm

•       Fragment může mít velikost až 300kb

•       Vektor je odvozen od konjugativního F-plasmidu u bakterií

•       Používané při mapování lidského genomu (Human Genome Project)





                                     Jak se tvoří DNA knihovny



•       Restriktázami štěpíme analyzovanou DNA, vzniknou inzerty



•       Stejnými restriktázami je roztěpen i vektor



•       DNA ligáza spojí vektor s fragmentem tzv.ligaceevzniká rekombinantní DNA



•        vpravení rekombinantní DNA do hostitelské buňky proces transformace, transdukce



                                     Genomové  X cDNA knihovny

                                        Reverzní transkripce

•      Enzym reverzní transkriptáza

•      Retrovirový původ

•      Ze ssRNA vytváří dsDNA

•      dsDNA stabilní, umožňuje použít restriktázy

                                      Hledání v DNA knihovnách



•       Sekvenci úseku DNA který hledáme označíme radioaktivně - tzv. DNA sonda



•       Denaturace sondy ssDNA



•       Denaturovat DNA u buněk, která nesou klonované fragmenty



•        Hybridizace-sonda označí ty klony,které mají sekvenci shodnou se sondou



•       Pozitivní klony jsou vybrány



                     Využití DNA knihoven v medicíně  a v molekulární biologii



•       Hledání nových genů, identifikace mutací určitého genu v genomu jiného organizmu, určení
funkce genu http://www.ensembl.org/index.html



    •    Restrikční analýza +Southern blot  http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/bio_g.swf

    

    

    

    •    PCR http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

    

    

    

    •    Sekvenování http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html

    

    





                                Využití DNA knihoven v medicíně a  
                                       v molekulární biologii





•       Produkce proteinů

    •    cDNA je  do vektoru

    •    Transformace bakterií či kvasinek (další eukaryota)

    •    Omezení-vzdálené organizmy jinou post translační úpravu

    •    Příklad: insulin

            Vakcíny

           





                                 Sledování exprese-DNA microarrays



                                 Využití DNA knihoven v medicíně, 
                               v molekulární biologii a v zemědělství



                                        Děkuji za pozornost