DNA Knihovny DNA knihovna lgenomová lcDNA GENOMOVÁ DNA KNIHOVNA l Knihovna genomové DNA je soubor fragmentů DNA jednoho organismu, které jsou uchovávány v plasmidech hostitelského organismu (např. bakterii). l V této formě mohou být fragmenty vyšetřovány pro identifikaci genů. Každý z fragmentů buněčné DNA vložený do klonovacího vektoru a pomnožený v hostitelské buňce představuje klon genomové DNA . l Soubor rekombinantních plasmidů nesoucích různé fragmenty představuje tzv. knihovnu genomové DNA. Vytváření genomové DNA knihovny ? • Izolování a vyčištění DNA 2. Natrávení DNA pomocí restrikčních enzymů 3. Vložení fragmentů do plasmidů 4. Zapečetění DNA pomocí DNA ligás v plasmidech 5. Vložení rekombinantních plasmidů do bakteriální buňky 6. Pomnožení bakterií na živné půdě l Knihovny genomové DNA se využívají především pro získání dostatečného množství genetického materiálu pro určení sekvence genomu. l Z genomové knihovny lze izolovat žádaný gen jen v některých případech. Jedná se především o bakteriální geny, jejichž kódující oblasti nejsou přerušeny nekódujícími sekvencemi (introny) a na poměrně krátkém úseku DNA zůstává celistvý gen. l Genomový klon obsahující žádaný gen lze identifikovat hybridizací se značenou sondou nebo jeho vnesením do mutantního hostitele, který danou vlastnost postrádá (je-li projev genu detekovatelný). cDNA KNIHOVNA l V případě vyšších organismů v jejichž genech jsou kódující sekvence (exony) přerušeny introny lze využít alternativní strategii – zpětný přepis mediátorové RNA (mRNA) do sekvence DNA. l V buňce z níž je mRNA izolována totiž po přepisu genu (transkripci) již došlo k vystřižení intronů z mRNA, její sekvence tak odpovídá celistvé kódující oblasti a je zakončena sekvencí několika desítek adenosinů. l Pro přepis mRNA in vitro se využívá specifické DNA polymerasy, enzymu reverzní transkriptasy (RT) izolované z retrovirů (1970; Baltimore a Temin). l Podobně jako jiné DNA polymerasy neumí RT iniciovat polymeraci de novo, ale vyžaduje přítomnosti krátkého úseku DNA (očka - primeu) již připojeného na matrici (mRNA) podle které vytváří komplementární vlákno DNA, tzv. cDNA (z angl. Complementary DNA). l Jako obecného primeru se v tomto případě s výhodou využívá krátkého oligonukleotidu poly(deoxyT) a vzniká heteroduplexní dvouřetězcová RNA/DNA molekula. RNA je následně naštěpena pomocí enzymu RNasy H a druhé vlákno DNA je syntetizováno pomocí DNA polymerasy, která využívá nerozštěpenou RNA jako primer. l Vytvořená dvouřetězcová DNA je následně vložena do klonovacího vektoru a vzniká cDNA klon. Soubor cDNA klonů připravený z mRNA izolované z určité tkáně se nazývá knihovna cDNA. l Na rozdíl od knihovny genomové DNA obsahuje knihovna cDNA pouze ty kodující sekvence, které jsou v dané buňce (tkáni) v daný čas exprimovány. l Knihovna cDNA je cenným materiálem umožňujícím predikovat aminokyselinové sekvence kódovaného proteinu nebo jeho nadprodukci proteinů v bakteriálních nebo kvasničných buňkách, které nejsou schopny vyštěpovat introny. Bude na měsíci knihovna ? l S tímto zajímavým nápadem jak zachránit život na Zemi v případě globální katastrofy přišla nedávno Evropská kosmická agentura. l ESA chce v budoucnu vytvořit na našem kosmickém sousedovi jakousi „Noemovu archu“, kde by byly uloženy vzorky DNA zástupců fauny a flory a také člověka. Vzorky z této knihovny by pak byly použity v případě globální katastrofy, tedy například kolize Země s cizím tělesem, nebo jaderné války. l Se sběrem a archivací vzorků DNA začali vědci před nedávnem, dostat něco na Měsíc umíme již od šedesátých let minulého století. l Jediné v čem tak trochu pokulháváme je zpětný postup, tedy ze vzorků DNA vytvořit zdravé zvíře či rostlinu. Díky velkému a rychlému rozvoji genetiky a příbuzných věd, bude i tento problém brzy vyřešen. Ona „Noemova archa“ by pak mohla být součástí lunární základny, která by měla na Měsíci vyrůst do dvaceti let.