Restrikční mapování Daniela Bartková Tatiana Adámusová Viktória Betinová Principem této techniky je specifické rozštěpení frakce DNA v místech zcela určitých sekvencí nukleotidů pomocí restriktáz. Restrikční endonukleázy = restriktázy § enzymy bakteriálního původu § štěpí komplementární vlákna DNA v určitých místech[ katalyzují hydrolýzu fosfodiesterové vazby v nukleové kyselině § rozpoznávají krátká místa na DNA (4-8 nukleotid.párů) § umožňují získat vždy stejnou sadu fragmentů § Nejpoužívanější jsou RE 2.typu-nejzn. je EcoRI (Escherichia coli restriktasa) Fyzická a restrikční mapa Fyzická mapa § Charakterizuje daný úsek DNA pozicemi různých značek [místa štěpená pomocí RE § Vzniká: - rozštěpením DNA pomocí RE - porovnáním velikosti fragmentů Restrikční mapa § Fyzická mapa štěpených míst § Vzniká: - porovnáním velikostí fragmentů vzniklých po štěpení několika kombinacemi RE § Schematické znázornění poloh a vzdáleností restrikčních míst na molekule § S jejich pomocí můžeme od sebe odlišit blízce příbuzné DNA Výchozí materiál restrikčního mapování § Neporušená izolovaná genomová DNA § Fragmenty DNA klonované ve vektorech či získané pomocí metody PCR Metody pro konstrukci restrikční mapy 1.Štěpení DNA dvěma nebo několika RE a vyhledávání překrývajících se restrikčních fragmentů § DNA štěpíme nejprve každým enzymem samostatně, poté dvěma enzymy současně § Stanovíme velikosti vytvořených fragmentů v každém štěpení § Srovnáme délky fragmentů a určíme polohy restrikčních míst pro každý enzym 2. Částečné štěpení DNA jednou RE a separace vytvořených fragmentů elektroforézou § Fragmenty poté izolujeme jednotlivě z gelu § Odštěpíme je stejnou RE ] vznik subfragmentů § Subfagmenty znovu separujeme elektroforézou § Soubory vzniklých subfragmentů jsou přiřazeny k prvotním fragmentům 3. Částečné štěpení radioaktivně značené na jednom z konců § Elektroforézou separujeme vytvořené fragmenty § Odečteme délky fragmentů z autoradiogramu § Je vhodné u větších molekul Konstrukce přesné restrikční mapy je podmíněna: § Identifikací všech vytvořených restrikčních fragmentů § Přímým stanovením velikosti fragmentů (určena elekroforézou) K čemu jsou dobré restrikční mapy? § Srovnáváni DNA různých jedinců či příbuzných organizmů bez nutnosti přesného stanovení jejich kompletní nukleotid. sekvence § Lze pomocí nich snadno zjistit polymorfizmy v sekvencích genomové DNA způsobené mutacemi [ substituce, inserce a delece nukleotidů § U klonovaných sekvencí DNA umožní lokalizovat geny na specifické restrikční fragmenty DNA [ usnadní izolaci a charakterizaci snadno sestrojitelné u DNA menších velikostí (viry, orrganely…) Děkujeme za pozornost.