Sekvencování DNA

                                      Co je sekvencování DNA?

•      Určování primárního pořadí bází v řetězci DNA

•      Analýza genomu

•      Odvození sekvencí aminokyselin

                                        Metody sekvencování

•      Maxam-Gilbertova metoda – chemická



•      Sangerova metoda – enzymatická



•      Další metody – pyrosekvencování, minisekvencování, hydrogensiřičitanové genomové
sekvencování, sekvencování pomocí hybridizace

                                     Společné rysy obou metod:

•      Příprava a separace fragmentů DNA, jejichž velikost se liší o 1 nukleotid



•      DNA s přesně definovanými konci (s místem pro vazbu primeru pro sekvencování)



•      Příprava souboru všech fragmentů ssDNA lišících se svou délkou o jeden nukleotid



•      Přesné elektroforetické rozdělení těchto fragmentů na základě jejich délky



•      Objeveny přibližně ve stejnou dobu

                                 Chemická(Maxam-Gilbertova) metoda

•      Označení řetězců na 5´konci (radioaktivně nebo fluroescenčně)

•      Separace řetězců DNA na ssDNA

•      Rozdělení vzorku jednoho řetězce na 4 díly

•      Na každý díl se působí chemickým činidlem, které selektivně modifikuje jeden nebo dva typy
bází; koncentrace činidel taková, aby došlo k modifikaci jen v malé části bází



•      Následné působení činidel vede k odstranění modifikovaných bází a k vytvoření zlomu řetězce

•      Separace vytvořených fragmentů eletkroforézou, autoradiografie a odečtení sekvence



                                   Enzymatická(Sangerova) metoda

•      Vytvoříme sadu stejných fragmentů ssDNA, na které navážeme primer.

•      Rozdělíme do 4 zkumavek

•      ssDNA s primerem slouží jako matrice pro syntézu komplementárního řetězce pomocí DNA
polymerasy

•      Reakce s DNA polymerasou při níž se začlení do syntetizované DNA místo normálního
deoxyribonukleosidtrifosfátu jeho analog, který působí jako koncový inhibitor syntézy DNA 
dideoxynukleosidtrifosfát (ddNTP). V každém ze 4 vzorků vzniknou fragmenty, které jsou zakončeny 

     příslušným ddNTP (ddCTP, ddGTP, ddATP a ddTTP).



•      Výsledkem syntézy v jedné zkumavce je směs různě dlouhých fragmentů zakončených stejnou bází.

•      Po denaturaci provedeme elektroforézu: naneseme na gel do 4 drah a podle vzájemné polohy
proužků přečteme pořadí bází(nejvzdálenější proužek od startu představuje primer + 1 nukleotid,
další primer + 2 nukleotidy atd.)





Poměr použitých bází dNTP a ddNTP je 100:1



    Enzymatická metoda se používá při plně automatizovaném sekvencování, syntéza DNA probíhá v jedné
reakci.



    Ke značení produktů se používají čtyřmi fluorescenčními značkami označené primery nebo ddNTP.



    Detekce produktů během elektroforézy probíhá pomocí laserového detektoru(laserem indukovaná
fluorescence, LIF) napojeného na počítač, který vyhodnocuje sekvenci.





•       Chemická

+   Ekonomicky nenáročná( bez jednořet. templátů, enzymů, synt. primerů)

+   Umožňuje sekvenovat i velmi krátké oligonukleotidy

+   Umožňuje sekvenovat i oblasti s takovou sek.strukturou, kterou žádná DNA polymerasa neprorazí

+   Sekvenujeme skutečně naši DNA a nikoli její kopii vzniklou in vitro

-    Nedají se dobře sekvenovat úseky delší než 250 b

-    Nespecifičnost chemikálií

•       Enzymatická

+   přesnější

+   jednodušší

+   možnost automatizované varianty

+   umožňuje sekvenování ručně až 400b, automaticky až 1000b





                                           Dobrou chuť!!!