Southern blotting

                           Lucie Adámková, Lucie Bauerová, Martin Bednář



                                         Základní informace

•      Pojmenování po E. Southernovi, který tento postup zavedl r. 1975

•      Metoda, která má významné uplatnění v diagnostice

•      Umožňuje lépe vizualizovat výsledky elektroforézy DNA

•      V doslovném překladu „pijákování“

•      Elektroforetický gel není vhodným materiálem pro provádění hybridizace DNA

                                           Samotný proces

•       1.Vycházíme ze situace, kdy proběhla elektroforéza DNA fragmentů

•       2.a)Pomocí alkalického pufru necháme vzlínat molekuly DNA z gelu na fólii (nejčastěji z
nitrocelulózy), v alkalickém prostředí zároveň DNA denaturuje (vlákna se oddělí, aby mohlo v příštím
kroku dojít k hybridizaci se sondou).

•       2.b)Jednořetězcová vlákna DNA, která jsou na membránu přenesena ve stejném pořadí jako byla
na elfor. gelu se fixují (teplem, UV zářením)

•       3. Na fólii necháme působit další pufr s nukleotidovými sondami (v nadbytku), které
hybridizují s komplementárními sekvencemi na fólii zachycených fragmentů DNA. Sondy jsou značeny
radioaktivním izotopem nebo (nyní častěji) fluorescenčním barvivem

•       4. Nenavázané próby (sondy) jsou odmyty.

•       5. Nyní již můžeme vizualizovat sondou značené fragmenty (podle použitého značení sondy buď
autoradiografií nebo detekcí fluorescence)  v případě úspěšné hybridizace svítí na membráně v určité
oblasti dvoušroubovice tvořená 1 vláknem próby a 1 vláknem studované DNA







                                            Eventuality

•      Northern blotting - označujeme tak vizualizaci elektroforézy RNA, která probíhá obdobně jako
v případě Southern blottingu.



•      Western blotting - používá se při elektroforéze bílkovin, pro jejichž značení se využívají
imunochemické metody.

 

•      Elektroblotting – přenos na membránu neprobíhá jen kapilárními jevy, ale za pomoci
elektrického proudu





                                               Význam

•      V oblasti diagnostiky geneticky podmíněných chorob

•      Je-li sonda krátká (okolo 20 nukleotidů) může se stabilně navázat při vyšší teplotě pouze
pokud je s cílovou sekvencí zcela komplementární - tímto způsobem lze například odhalit bodové
mutace (záměny bazí) v některých genech.

•      Pomocí Southern blottingu lze studovat polymorfismus DNA, tj. rozdíly v nukleotidové sekvenci
různých alel

•      Umožňuje z velkého množství fragmentů o podobných délkách (jež můžeme získat např. po štěpení
celkové DNA pomocí restrikčních endonukleáz) specificky detekovat DNA fragment