Gelová

                                           elektroforéza

                                           Elektroforéza:

n     Separačná metóda, ktorá využíva schopnosť nabitých častíc pohybovať sa v elektrickom poli

n     Objavená r. 1948 – Arne Tiselius /Nobelova cena za chémiu/

                                            1902 - 1971

                           Použitie na analytické aj preparatívne účely:

n   Separácia veľkých molekúl – proteíny alebo nukleové kyseliny

n   Separácia menších nabitých molekúl – cukry, peptidy, nukleotidy

                                             Princípy:

n    Rýchlosť pohybu častíc závisí na veľkosti náboja a veľkosti molekuly

n    Pohyblivosť látky ovplyvňujú: celkový povrchový náboj, veľkosť a tvar molekuly, koncentrácia
nosiča



                                     Elektroforéza na nosičoch:

n    Nosiče musia byť hydrofilné, nerozpustné vo vode a majú mať čo najmenšie adsorpčné schopnosti

n    Najpoužívanejšie nosiče: agarózový a polyakrylamidový gel

n    Nosiče vytvoria zložitú sieťovú štruktúru s pórmi

n    Veľkosť pórov možno ovplyvniť složením roztoku a koncentráciou polyméru



                              Horizontálna a vertikálna elektroforéza:

                                Praktické prevedenie elektroforézy:

n    Roztok agarózy sa vyleje do pripravenej formy s hrebienkom

n    Po ochladení a gelifikaci sa vyberie hrebienok aj gel z formičky

n    Plátok gelu s jamkami sa vloží do elektroforetickej vaničky a zaleje sa pufrem



n    Elektroforéza musí prebiehať vo vodnom roztoku o stálom pH, preto sa používajú pufry

n    Ich úlohou je neutralizovať ionty H^+ a OH^-, ktoré vznikajú hydrolýzou vody na elektródach

                                    Nanášanie vzoriek DNA na gel

                                             Výsledky:

n    Po skončení elektroforézy je možné vzorky zafarbiť ethidium bromidem

n    Po vložení do UV-transiluminátora molekuly DNA žiaria

                                     Vzorky na agarózovom geli:

                                  Zistenie molekulovej hmotnosti:

n    Poloha konkrétnej molekuly záleží na sile elektrického pola a dobe putovania gelom-teda na
okamžiku kedy vypneme zdroj el.energie

n    Molekulovú hmotnosť zistíme porovnaním s veľkosťami známych molekúl, ktoré nazývame markery
molekulovej hmotnosti

                                         Zdroje informácií:

n   http://biologie.upol.cz/metody/Trideni%20molekul%20nukleovych%20kyselin.htm

n   http://sweb.cz/biochemie/x/metody/elektroforeza.htm

n   sweb.cz/biochemie/x/metody/elektroforeza.htm

n   www.lf2.cuni.cz/Ustavy/biochemie/vyuka/elektrofor.ppt