Vektory pro klonování genů Pojmy • klon - soubor identických buněk (organizmů) odvozených ze společného předka mitózou u eukaryot a prostým dělením u prokaryot • klonování DNA - namnožení určitého úseku DNA pomocí klonovacího vektoru • klon DNA (molekulární klon) - soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA • klonovací vektor (přenašeč) - molekula DNA, která má schopnost přijmout cizorodou DNA ,spojit se s ní a autonomně se replikovat v hostitelské buňce • cizorodá DNA - jakýkoliv úsek DNA vloženy do klonovacího vektoru • rekombinantní molekula DNA - molekula DNA vytvořená in vitro spojením cizorodé DNA s klonovacím vektorem Postup klonování • Příprava rekombinantní molekuly DNA • Vnesení vektoru do hostitelských buněk • Selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA 1. Příprava rekombinantních molekul DNA Cizorodou DNA získáme ke klonování různými způsoby: • genomovou DNA izolovanou z donorového organizmu • štěpení genomové DNA restrikční endonukleázou nebo mechanickým stříháním na kratší fragmenty • předpokladem účinného spojení fragmentů s vektorovou DNA je vzájemná komplementarita jejich konců • komplementární DNA (cDNA) připravenou zpětnou transkripcí z mRNA • DNA připravenou uměle chemickou syntézou Příprava vektorové molekuly: • ke spojení s cizorodou DNA je nutné její štěpení restrikční endonukleázou, která vytváří komplementární konce ke koncům cizorodé DNA • klasický vektor pro klonování je v E.coli plazmid pBR322 • obsahuje geny pro rezistenci na ampicilin a tetracyklin a rekogniční sekvence pro 10 různých restrikčních enzymů • některá restrikční místa leží i uvnitř genu pro rezistenci `a je-li integrována cizorodá DNA do tohoto úseku, projeví se to ztrátou rezistence na dané antibiotikum Spojení cizorodé molekuly s vektorem • po vytvoření směsi takto připravených molekul se jejich konce vzájemně spojí (renaturují) a po přidání DNA-ligázy se mezi nimi vytvoří kovalentní vazba • vzniká tak kružnicová rekombinantní DNA ve formě rekombinantního plazmidu, který se přenese do vhodného hostitele 2. Vnesení vektoru do hostitelských buněk 3. Selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA • po přenosu plazmidových molekul je třeba identifikovat buňky obsahující rekombinantní plazmidy a odlišit je od buněk bez plazmidu a buněk do nichž byl přenesen plazmid bez cizorodé DNA • restrikční analýza • cizorodou DNA vyštěpenou z rekombinantní DNA pomocí restrikční endonukleázy lze dokázat elektorforézou v gelu • inzerční inaktivace • pokud je klonovací místo ve vektoru umístěno v genu odpovědném za rezistenci k antibiotiku, inzerce cizorodé DNA vede ke ztrátě funkce • buňky se stanou citlivé k antibiotiku, čímž je lze odlišit od buněk obsahujících vektor bez cizorodé DNA • hybridizace • buňky s rekombinantním plazmidem jsou vyhledávány pomocí sondy specifické pro sekvenci inzertu Vektory • Jako klonovací vektory se nejčastěji používají kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace, odvozené zejména z plazmidů nebo virů. • klonovací kapacita vektoru maximální délka fragmentu DNA, který může být do vektoru začleněn a stabilně udržován • dosahuje až 16 kb Ideální klonovací vektor odvozený od plazmidu by měl mít tyto vlastnosti: • malou velikost • čím menší je plazmidová DNA, tím je její přenos do buněk účinnější (snadno izolují a v buňkách dosahují vysokého počtu kopií) • schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při replikaci a uchovávání klonů • schopnost snadného a účinného přenosu do hostitelských buněk • musí obsahovat geny , na základě jejichž fenotypového projevu lze buňky nesoucí plazmid snadno selektovat • označují se selekční markery (nejčastěji jsou to geny, které propůjčují buňkám rezistenci k antibiotikům, např. k ampicilinu, tetracyklinu nebo neomycinu) • musí nést vhodná klonovací místa • tj.jedinečná restrikční místa pro restrikční endonukleázy, do nichž se začleňuje cizorodá DNA Kosmidy • jsou to vektory odvozené od plazmidů, do nichž byla naklonovaná místa cos z bakteriofága lambda • lze tak spojit výhody klonování do plazmidových a fágových vektorů • rekombinantní DNA lze zavést do hostitelských buněk procesem normální fágové infekce (účinnost je o několik řádů vyšší) • oproti plazmidovým vektorům má až 2x vyšší klonovací kapacitu • přítomnost místa cos na plazmidu umožňuje, aby rekombinantní DNA byla sbalena do fágových kapsidů sbalovacím extraktem fága lambda a přenesena do hostitelských buněk fágovou infekcí • v buňkách nabývá kružnicové formy a replikuje se jako plazmid • do fágových hlav může být sbalena DNA o délce 37-52 kb a velikost kosmidů je zhruba 5kb, lze tedy pomocí nich klonovat DNA o velikosti 32-47 kb Vektory pro speciální účely • expresní vektory • obsahují silný promotor umístěny proti směru transkripce od klonovacího místa • po naklonování cizorodého genu může dojít k jeho expresi a tvorbě příslušného produktu, který může vést ke smrti hostitelských buněk Význam • Hlavní přínos klonování DNA tkví v možnosti izolovat z genomu dílčí úseky, ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně množit a zpřístupnit je tak ke studiu.