Hemostáza Ø je schopnost organismu zastavit krvácení Ä udržení tekutosti krve při něporušeném cévním řečišti Ø účastní se: Ä cévní stěna øendotel Ä látky přítomné v krvi a na vnitřní straně cévy: øtrombocyty øčervené krvinky, leukocyty ølipidy, bílkoviny, minerály atd. Ä porušená tkáň: øtkáňový faktor øADP Poranění = poškození endotelu Primární hemostáza Hemokoagulace Hemokoagulace Fibrinolytický systém Inhibitory koagulace a fibrinolýzy Hemostáza Ø primární Ä vasokonstrikce ihned Ä adheze trombocytů sekundy Ä agregace trombocytů sekundy až minuty Ø sekundární (koagulace) Ä aktivace koagul. faktorů sekundy až minuty Ä tvorba fibrinu minuty Ø fibrinolýza Ä aktivace minuty Ä lýza krevní sraženiny hodiny Poranění = poškození endotelu Endotel Ø je aktivní jednovrstevná buněčná výstelka všech cév, kapilár a serózních dutin Ø je místem kontaktu látek a buněk kolujících v krvi a látek navázaných na povrch endotelu Ätyto buď cirkulují v krvi a na endotel se váží nebo Äjsou endotelem syntetizovány Ø je důležitým zprostředkovatelem a regulátorem látkové výměny mezi krví, lymfou a tkáněmi Endotel Cévní tonus Ø endotelové buňky kapilár uvolňují látky, které regulují prokrvení orgánů, způsobují převážně vasodilataci, např.: Ä metabolity kyseliny arachidonové, např. prostacyklin PGI[2 ]- tromboxan A2 Ä NO - endotelin Ä bradykinin (potencuje uvolnění NO) Endotel - hemostáza Význam pro hemostázu Ø EB na jedné straně podporují srážení (vWF) Ø na druhé straně produkují faktory aktivní ve fibrinolýze Ø v klidovém fyziologickém stavu převažují látky působící proti krevnímu srážení V endotelu jsou syntetizovány Ø Von Willebrandův faktor Ø Platelet Derived Growth Factor (růstový faktor odvozený z destiček) Ø destičky aktivující faktor (PAF) Ø prostaglandiny, prostacyklin Ø glykoproteiny, fibronektin, trombospodin Ø některé typy prokolagenu Ø Endothelium Derived Relaxing Factor (z endotelu odvozený faktor = NO) Ø endotelin-1 a další Endotel - vlastnosti Antitrombotické Ø vazodilatace Ø modulující zánět Ø potlačující růst Ø prostacyklin - PGI[2] Ø NO = EDRF Ø aktivátory plazminogenu Ø proteoglykany (heparan) Ø trombomodulin Ø protein C, S Prokoagulační Ø vazokonstrikce Ø podporující zánět Ø podporující růst Ø tkáňový faktor Ø PAF Ø vWF Ø PAI Markery aktivace a poškození endotelu Ø TF Ä exprimovaný na povrchu endotelu odráží stupeň jeho stimulace Ø t-PA, PAI-1 Ø trombomodulin Ø vWF Krev Tekutá část – plazma Ø Voda Ø Organické látky Ä Bílkoviny Ä Sacharidy Ä Tuky Ä Hormony Ä Vitaminy Ä Enzymy Ø Anorganické látky Buňky – krevní tělíska Ø Červené krvinky Ø Bílé krvinky Ø Krevní destičky Poranění = poškození endotelu Krevní destičky Funkce trombocytů při zástavě krvácení je dvojí: Ø tvorba primární krevní zátky, Ø tzv. prokoagulační Ä tj. poskytnutí povrchů = fosfolipidů pro průběh koagulačních dějů - PF3 øvazba na vit. K závislých faktorů: FII, VII, IX, X øvazba kofaktrů: FV, VIII øvazba a aktivace: FXI, XII Účast destiček v hemostáze: Ä adheze Ä změna tvaru Ä uvolňovací reakce Ä agregace Ä přesun negativně nabitých fosfolipidů na povrch Ä retrakce Granula trombocytů a-granula Ø DF4, bTG– neutralizace GAG Ø vWF – adheze, agregace Ø FV – prokoagulačně Ø PAI-1 – inhibice fibrinolýzy Ø PDGF – růst tkáně, hojení Ø trombospondin – agregace Ø fibrinogen – agregace Ø fibronectin – adheze Ø PS – inhibice koagul. FF denzní granula Ø ATP, ADP - agregace Ø Ca - agregace - vazba koagul. FF - tvar-změna, retrakce Ø serotonin - vasokonstrikce Ø P-selektin – váže leukocyty Adheze Ø přilnutí krevních destiček na jakýkoliv povrch s výjimkou dalšího trombocytu Ø vedle trombocytů se na ni podílejí Ä struktury subendotelu Ä plazmatické adhezivní proteiny: vWF, fibronectin Ä hemodynamické změny (smykové rychlosti, množství a viskozita krve, velikost a tvar cév). Ø adheze je přímo lineárně závislá na počtu trombocytů Von Willebrandův faktor Ø je adhezivní protein Ø tvořen v endotelu a megakaryocytech Ø hraje klíčovou roli v primární hemostáze a koagulaci Ø zralý vWF představuje sérii multimerů od 500 kD až přes 10.000 kD, každý s komplexní strukturou Ø cirkulující vWF se váže s FVIII vWF - primární hemostáza Multimery o vysoké molekulové hmotnosti Ø adheze trombocytů k subendotelovým strukturám prostřednictvím GP Ib Ø agregace vazbou na aktivovaný GP IIb/IIIa vWF - funkce v koagulaci Multimery všech molekul. hmotností Ø váže a stabilizuje FVIII (ochrana před proteolytickou degradací) Ø lokalizuje FVIII v místě poruchy cévní stěny Ø uvolňuje FVIII do oběhu Ø efekt kofaktoru při aktivaci FVIII trombinem Adheze (ale i trombin) navodí s aktivací receptorů komplexní aktivaci trombocytů Ø ztráta diskoidního tvaru, tvorba pseudopodií (vývěžků) Ø centralizace granulí a přeměna cytoskeletonu Ä uvolnění působků z granulí (sekreční fáze): øADP, PDGF, PF4, bTG, fibrinogen a další Ø metabolizmem kyseliny arachidonové vzniká TXA2 Ä výrazný stimulátor agregace trombocytů Ø aktivace receptorů GP IIb/IIIa Ø přesun negativně nabitých fosfolipidů na povrch Ä umožňují vazbu koagulačních faktorů v místě krvácení Agregace Ø je vzájemné spojení destiček mezi sebou Ø probíhá s pomocí specifického komplexu závislém na Ca^2+, GP IIb/IIIa a fibrinogenu Ä fibrinogen slouží jako můstek mezi destičkami; nereaguje s klidovými destičkami Ø za vysokých smykových rychlostí je adheze a agregace trombocytů zprostředkována vazbou vWF na GPIIb/IIIa a to i v nepřítomnosti fibrinogenu Ä primární agregace ø ADP z porušených buněk a tkání - reverzibilní Ä sekundární agregace ø ADP a TXA2 z trombocytů – ireverzibilní Ø vznik bílého destičkového trombu Retrakce Ø = smrštění vytvořené krevní zátky Ø jedná se o destičkovou funkci, která je analogní kontrakci svalů Ø slouží k podpoře uzavření rány Ø pro retrakci jsou destičky nezbytné Ø pseudopódia destiček přilnou k fibrinovým vláknům a retrakce kontraktilních bílkovin destiček (tj. „zatažení“ pseudopódií) vyvolá retrakci sraženiny Hemokoagulace Plazmatický koagulační systém Proenzymy Ø serinové proteázy: FII, VII, IX, X, XI, XII, PK PLG, tPA, uPA, PC Ø transglutaminázy: FXIII Kofaktory: Ø plazmatické: FV, VIII, HMWK PS Ø buněčné: TF TM, EPCR Substrát: fibrinogen Regulační proteiny: AT III, HC II, C1inh, a2AP, PAI-1,2,3 PC, TFPI, a2MG Fosfolipidy (negativně nabité): fosfatidylserin, fosfatidyletanolamin Ca^2+ Hemostáza a tkáňový faktor (TF) Ø transmembránový glykoprotein Ä v subendotelu na fibroblastech a svalových buňkách Ä fyziologicky na všech buňkách mimo cévní řečiště Ä za patologických stavů i na monocytech a endotelu Ø tkáňový faktor není za normálních okolností vystaven působení cirkulující krve Ø hemostázu zahajuje tvorba komplexu mezi TF a FVIIa Ø tvorba komplexů TF-FVIIa na povrchu buněk nesoucích TF vede k aktivaci FIX a FX Zahájení (iniciace) koagulace Zahájení (iniciace) koagulace Fáze aplifikace koagulace (priming= narůstání) Propagace (šíření, rozmnožení) koagulace Propagace koagulace klíčové enzymatické komplexy Ø Tenáza (vnitřní) Ä FIXa Ä FVIIIa Ä fosfolipidy Ä Ca Zahájení tvorby trombinu Ø Vytvoření iniciálního malého množství trombinu se následně podílí na aktivaci dějů, které zvyšují tvorbu trombinu více než 1000-násobně ÄAktivuje koagulační faktory V, VIII, XI Ø Pomáhá aktivovat trombocyty v místě poranění, které následně poskytují negativně nabitý fosfolipidový povrch nutný pro další aktivaci koagulačních faktorů Množství trombinu je rozhodující pro: Tvorbu dostatečné a pevné fibrinové zátky Aktivaci FXIII, vedoucí ke stabilizaci fibrinové sítě Aktivaci TAFI, zajištující rezistenci fibrinové zátky k fibrinolýze Protease-activated Receptors Ø Receptory spojené s G-proteinem Ø Jsou schopné přeměnit EC probíhající proteolytické štěpení v transmembránový signál Ø Prototypem skupiny je PAR1 Ä Je aktivován, když trombin odštěpí jeho N-konec Ä Při této aktivaci se objeví nové N-zakončení, které slouží jako liganda – váže se IC na „tělo“ receptoru a slouží jako transmembránový signál PAR Poranění = poškození endotelu Poranění = poškození endotelu Fibrinolýza Ø patří k základním fyziologickým mechanizmům Ø má dvě funkce v procesu hemostázy Ä odstraňuje fibrinová koagula po té, co naplnily svou funkci Ä limituje tvorbu koagula Ø hraje dále roli v procesech zánětu, metastazování nádorů, ateroskleróze, odlučování placenty a embryogenezi Fibrinolýza Vnitřní cesta (krevní) Zevní cesta (tkáňová aktivace) kalikrein, (FXIIa, FXIa) tPA, uPA C1INH, ATIII PAI-1, PAI-2 Plazminogen PLAZMIN Plazminogen a2-antiplazmin fibrinogen fibrin FVa,VIIIa Aktivace fibrinolýzy silné aktivátory tkáňový aktivátor plazminogenu - tPA urokinázový aktivátor plazminogenu - uPA slabé aktivátory kalikrein fXIIa, f XIa Aktivace fibrinolýzy - přeměna plazminogenu na plazmin Ø Fibrinolýza - po formaci fibrinu dojde k navázání jak plg tak t-PA na jeho povrch Ø Následkem této vazby je tvorba komplexu, který výrazně urychluje formaci plazminu Ø Na fibrin navázaný plg je výrazně lepším substrátem pro t-PA než volný plg Ø Navíc – navázaný plazmin je chráněn před inaktivací a2AP Formy plazminogenu, plazminu plazmin aktivátor plg Lyz - plazminogen (mol.hmot.82 000) Glu - plazmin Glu aktivátor plg plazmin lyz - plazmin vazebné místo pro lyzin - S - S - disulfidové můstky Fibrinolýza Vnitřní cesta (krevní) Zevní cesta (tkáňová aktivace) kalikrein, (FXIIa, FXIa) tPA, uPA C1INH, ATIII PAI-1, PAI-2 Plazminogen PLAZMIN Plazminogen a2-antiplazmin fibrinogen fibrin FV, VIII FVa,VIIIa FVai, VIIIai Štěpení fibrinogenu plazminem Štěpení fibrinu plazminem Inhibitory fibrinolýzy Ø inhibitory plazminu: Ä alfa[2]-antiplazmin Ä TAFI - Trombin Activated Fibrinolysis Inhibitor Ø inhibitory aktivátorů plazminu: Ä PAI-1 (endotel) Ä PAI-2 (placenta) Ä PAI-3 (úloha v patofyziologii fibrinolýzy je nejasná) Nespecifické inhibitory fibrinolýzy Ø přirozené inhibitory serinových proteáz: Ä svůj inhibiční vliv uplatňují zejména proti plazminu Ä patří sem: a[2]-makroglobulin a[1]-antitrypsin C1- esterase inhibitor ATIII Ä jde za fyziologických stavů o slabé inhibitory Ø jiné mechanismy inhibice fibrinolýzy: Ä HRGP, trombospondin, lipoprotein (a) TAFI Ø Thrombin-Activated Fibrinolysis Inhibitor Ø Syntetizován v játrech Ä Glykoprotein – mol. hmotnost 55 kDa Ä Metalokarboxypeptidáza - obsahuje zinkové ionty Ø Předpokládá se, že TAFI koluje v plazmě v komplexu s plazminogenem Ä TAFI se váže s 10x vyší afinitou k lyz-plazminogenu (x glu-plg) Ø Poločas cirkulujícího TAFI – několik hodin Ä Hladina TAFI je podmíněna geneticky Aktivace TAFI Ø Pouze trombinem – neefektivní – potřebná velká množství IIa Ä V přítomnosti trombomodulinu probíhá reakce 1250x rychleji Ø Aktivace plazminem pomalejší Ä Vyžaduje přítomnost glykoasaminoglykanů endotelu Ä Úloha plazminu v aktivaci TAFI zatím není jasná Ø Fyziologicky IIa předchází plazmin a je účinnější Působení TAFIa Ø odštěpuje z fibrinu lyzinové zbytky Ä odstraní tak vazebná místa pro plazminogen a t-PA Ø uvolňuje PAI-1 z trombocytů Ø inhibiční efekt TAFI je dále podporován aktivací TAFI plazminem a inaktivací plazminu TAFIa (přímá inhibice) Ä přitom ale plazmin inaktivuje také TAFIa Fibrinolýza a koagulace Ø Aktivace TAFI trombinem indikuje důležitost koagulačního systému v regulaci fibrinolýzy Ø Veškeré poruchy generace trombinu mají za následek i zvýšenou rychlost fibrinolýzy Ø Toto bylo jako první potvrzeno pro defekty FXI – krvácení z tkání s bohatou lokální fibrinolýzou Ø Naopak – zvýšená aktivita TAFI Ä buď v důsledku zvýšené aktivity koagulačních faktorů Ä nebo samotného TAFI je považována za trombofilní stav TAFI a trombomodulin Ø Přidání TM k faktor deficitní plazmě (VIII, IX, X, XI) koriguje in vitro předčasnou lýzu koagula Ø TM hraje v koagulaci dvojí roli Ä V komplexu s IIa aktivuje PC na APC - důležitá je přitom koncentrace TM Ø Při nízké koncentraci je stimulována aktivace TAFI na TAFIa (antifibrinolytické působení TM) Ø Při vysoké koncentraci je aktivace potlačována (zvyšována aktivace PC – profibrinolytické působení TM) Ø Navíc je zřejmě důležitá i velikost cév – koncentrace TM na endotelu stoupá směrem ke kapilárám Dvojí úloha trombomodulinu Přirozené inhibitory koagulace Ø serpiny (inhibitory proteáz): Inhibovaná proteáza: Ä Antitrombin (IIa, Xa) Ä HC II (IIa, Xa) Ä a-1-antitrypsinm (Xa, aPC) Ä C-1inhibitor (kalikrein, plazmin) Ø systém proteinu C: (Fva, FVIIIa) Ä protein C, S Ä C4bBP Ä TM Ä inhibitor akt.proteinu C Ä EPCR Ø TFPI (TF/FVIIa/FXa) Ø nespecifické inhibitory: Ä alfa2 MG (IIa, kalikrein, plazmin) Antitrombin Ø Přirozeně se vyskytující inhibitor proteáz Ø Další serpiny: heparin kofaktor II, a[2]-antiplazmin, PAI-1, PAI-2, protein C inhibitor, a[1]-proteinase inhibitor (antitrypsin), a[1]-antichymotrypsin, C1inhibitor Ø Serpiny tvoří s cílovými proteinázami ireversibilní 1:1 komplex Antitrombin Ø Je hlavní fyziologický inhibitor trombinu (IIa) a faktoru Xa Ä inhibuje i IXa, XIa, XIIa a fragmenty, kalikrein, plazmin, TF-FVIIa Ø přítomnost heparinu a heparinu podobných látek (glykosaminoglykanů - GAG) urychluje tuto reakci 1,000 - 2,000x - vazba na AT je reverzibilní Ø GAG mají úlohu kofaktoru v této reakci Antitrombin Antitrombin Ø Protizánětlivé působení - schopnost AT stimulovat tvorbu prostacyklinu v buňkách endotelu Ä prostacyklin působí øvazodilataci øinhibičně na destičky øinhibičně na aktivaci mononukleárů øindukci rezistence na endotoxin Ø Heparin inhibuje tuto funkci AT Systém proteinu C XIIa FVIIa-TF XIa FVIIIi FIX FVIIIa FVIII FX FXa FIXa FVi FVa FV FII FIIa fibrinogen FIBRIN Ca^2+ TM PC APC PS Protein C Ø K-dependentní glykoprotein, serin. proteáza Ø syntetizován v játrech jako jednořetězový polypeptid Ø v plazmě přítomen zralý dvouřetězový protein (těžký řetězec 41kDa, lehký 21 kD) Øaktivován na endotelu komplexem IIa/TM Protein S Ø K-dependentní protein Ø syntetizován v játrech, cévním endotelu, megakaryocytech a d. Ø uložen v a-granulích trombocytů Økofaktor APC při enzymatickém štěpení kofaktorů Va a VIIIa Ø nezávisle na APC přímo inhibuje faktory Va a Xa Protein S Ø koncentrace v plazmě 25 mg/L Øv plazmě je asi 60% nekovalentně vázáno (komplex 1:1) na C4BP Ø vázaný PS již nemá funkci kofaktoru Ø funkce tohoto komplexu v systému komplementu je neznámá EPCR - receptor endotel.buněk pro PC Ø transmembránový protein typu 1 Ø homologní s HLA 1.třídou/CD1 - buňky zahrnutý v imunitní odpovědi Ø podporuje aktivaci PC na endotelu Trombomodulin Ø transmembránový protein Øv komplexu s trombinem aktivuje PC Øv komplexu s trombinem aktivuje TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) Ø urychluje inhibici trombinu antitrombinem C4b-BP Ø regulační protein cesty komplementu Ø multimerní protein složený ze 6-7 a řetězců s nebo bez b řetězce Ø forma s b řetězcem (C4b-BP b+) - 80% celkového proteinu Ø pouze forma s b řetězcem váže PS Øvazba je reverzibilní TFPI Poranění = poškození endotelu