Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologicka klinika Fakultní nemocnice Brno a MU Brno the Cz£ch Leukemics studu group for liře Klinická praxe Vyšetřovací metody morfologické imunologické cytogenetícke molekulárně cytogenetícke molekulárně genetické 9 Too J\iuJiuuii>^^ 30 - 40 cycles of 3 steps : Slep 1 : denaluratíon 1 minut 9A °C HnTTTTirnrnTTTn^ y y liimuin nu y Step 2 : annealing 3 45 seconds 54 ÖC forward and reverse primers !!! I \ I I I _rn~rrriTTTrrTrrr^^ y step 3 - extension —■— I I 'V J . _ 1 ^ __ I • -^" 2 minutes 72 °C 5,mTrnTTTTn^!'l -íľTlľ*-3' ,,« - ~ ' - 'i S on,y dNTP's 1st cycle 22=4 copies 35th cycle 2 36 = 68 billion copies 12 5939 6�0087 4 ;a£ Life at High Temperatures Hot spring near Great Fountain Geyser Enzymatic Amplification of ß-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia fandst!] K. Saiki. Stephen Sdvarf. Fred Fakxma. Kary E. MuUis Glenn T. Hum. Henry A, ErILch. řfonn«! Arnhiiö Recent advances in «ronuiiliant SM A technology have trade possible the molecular analysis and ppniatal diagnosis of liveroJ hcmac- cenetie diseases. reoU DNA obtained by imiiMíCfllcsis « chorionic »iHiii tampltni tin 1* inalyieil by «slrich'on enzyme JÍBÍ5IÍM. «oEh subs*-c.uent eleetiophofesis. SonLherri triiAi-fcr, and spceihc hyhidizsiKHl iff cloned jane «r ou'jonueleoiide prabes. Wim Thts disease milks from hjmoiyBosily jT U* i«Jtle-celL allele IĚS) ai lit p> itobiA gtrw twm. The S üllels diners from the »iW-type alíek «*"» ,kí pnmtr-meimitJ (iKvntórif Wi/ff Urion «f Jp«ŕ/K PJ-»ifl*in mnjfr JeoiríflCfí '» í"t*"l= DNA. wuliiitf in ihi upmtniivl avrtair <2t>.""'"" rjHřo^ífřojf JieŕJríiifl o/ a» «u/.iieíefW aBimaeltouát rmbt hynrioW at abukxt iff ihr tinptUkd frglabtn n^ncej, ľ*e p-ííaKu ři*>fypf w *e dutinnA«) i" I«l utaw ŕ Jay oy íňůre direít mcúňtl in "bittl aialysi» ai iht ftUJi akmc i» ttifficKPi í« ciiínŕin. For es-ample, lili siíEiieisii of Kydtopi felilii thoTüoay^oiis íi-ihalaiwirtial íai be m*d* by doíiwťicíiunt Ihe atfltncc cf *ny (i-lltiDid (tntí by hybndiiAiioti with m ,-.■ ..>l-i i pnibe O-l). HoirrtlViOlÜT f«* teriiin S-ihBlm*™» alleles f> ^t dí' twťiuňed i a Süülheni rcanifer espen-TTKňES by Tising QLiawicCleotide probel ijiac forai stíWr JupleK* *ilh lile i**í-mi| p-globin t^ae seidiíÄňfic bet fp^m uniiaMe hvbi-ms untb leecilic muiaaii iS. 71-Sickle atü inanii cm alio be Jiai-l by dire«! »mIhu of fetal ona. Lained by ídňniocenliesiiof chorem«: vJ-bii sampliflS íim °e trtaicd. with a fe-íinccion ertdünudez** ifor e^ijaple. Dne ] ssvt Hit lít ilui recosniiti a sequence iJiej«! by llie p1 mutatwi <*-II). This lenentH 6*- ana ŕ^ípttifit íeioiction iiiiumer-i íha* san b= «-soWeJ by SvrnUem inmifcr and hyMid-ixatioťi w^tli a Q-úlobin pfůbe. We have ítívtlooeij a proceduie (oř the ieleeiion af Ure oetle cell muLlúon ihlt ii very raoid and ii al le«i ľ™ ordere «ľ mayuhide mW* WPSU!« ümd iiaiidart SuUlhim blomiig. Thttí air twü special featutei to ihiipcolo«!. The fint is a method for aanpufyiiii ipccük: p-(kjbin BN A sequence! «Till the uae of oliBHiucleůddje orapen and DMA poly-nieiwe ui)- The vetimd is (lie analysis jí che ö-6JobUi iencuypŕ by ioIuiimi hy-bTidiiitiOfl of the aoieüSed UNA wnh a speciíe oliiiomKKeitide probe and subsequent ilijesiicn wiih a testtittiOJl tfl-dcmuelcaie tŕ/í. Ttvtae vw itchiiKajei Lmetense the ipeed and «nsilivHy, and Hist« (heeptnplexily ofrrenaial di>£DO^ sii for sickle cell anemia; !hey may tlst, he jHierally appltcůhje m lJw Jiujiii^w ůf other Rencuc JLseases ajid in Lh.c jíc of DNA probes foi inCtciJoiti diuaje l.i^.-- SHlUflKC Jmulilitii.i-n. bT puyuerutt cbÉiJl ti:;'--i.iin. We use a iwůiictp procedure Tat detenmnio( the p-jWim jeno-Lyee of ^íin.i i genomic DMA samplet* Finth a snsall portion i>f ilie |S-sbohin geno sequence ipannintlhepolymůtoiiic; Úde I rcstrieilůn sile dwespůsltf] ůf Uie 3* slick is smplillcd. Men, the aicience pr abjavoe of the Dde L leiiricuon ii« q> the amplified DNA mcople a dnirniia** by solution hybridization *lih an end-labeled cůfflciljetnentary uligůmef followed by peeiiicuon codůniictcise diae». lion, slectroebotesis, ami auioradiop* ^ ™.L The p-sKViCi {tne Miminu "is unph-hed by the imlymennc chain teacifaH (PCFa proeedute of Mulin and Falooni ill} in wliidi we uied two 20-iase olbjo-niieleoiide pfiowrs that Hank Hie repoa to be amplified. One juimer. PC«, ii eůflaplemeoiaey to the (^ř^icaild and the ^liiei, PCOJ, is complemcntiry to ±e i-)-iirand (fie. !>■ The anneaJiiii cf PCÍH to the (- )-SLraiid ď dtíaiuted íe-nomic- DNA followed by ciiínuon uňlh ihe Kkr-'v- fragment .^i .'.'riv:ŕ.-i -i-:- tok DffA polymeriií I and deesTOucleotkle triphosphate» results in the syntnt sis of a C - ■:'.: and fraginc n: c jni.iinin? [be lariee »qibeoee. Al the same tune, a simdir reaction occurs with PCD3, creaiim a ne«l + )-5t[and- Since these at*ly sya-,;,.- DNA strands are uiemtelrt» itn^late for the PCR prime«, irpe«iid íycles of denaiutation. pnmer SAiiealiCvI. and fiicnsicm «suli in the emvKiential xuuniilatjan Of'he llů-ba« půirreBion delincd by the primers. ,\n ciajnple Pi !he depee uť iDeff* gene ampliFjcaiiDii achieved by me CCÍ (iküuH is shown m Fie. 1A. Sanipici« DM A 11 lath were amplified fpr ÍŮ cyeW indiifosiion of each sarr.ulc. cqunalecú to » ill oi the ůíifinal DM^. w»i si*-jefied to alltili™ Jti eleclroplioresii**' trantrcrred 10 a nylon filter- fhe filiB was then hybridised ^th a l;p-|ll!«Jr 4fl-baic oliíoniielíioiide urtbí. S^*-wtiieli is complimentary i# ihe lanp winteoct iFii- IA> buf am is (he W1 pn«eri. The reiulti. jileri ;-botirai*15' radingraoruc cKpoinrcL tliow thai a Ě*ř nseot hybriditiiii "nh ihe US* pw* TU luimn m i He tertflü« ínľlS Sind. Ľnir™Ľ., cjlifan™ M«- rre i^r E^ei. Lnnrmiy ^ 5*iüKm C*iŕw*a. L*1 *^ \A »OCTJU" Science, 230 (4732): 1350 AaJU'Jť'.CATIrt^ KOR TICK SCIENCE THF MOLECULE OFTHEYEAR .-! discussion of i/teyears I V/J^\Vřl nmß»sde>ilißc(kn'l(s(mK')Us. TaqDNA Polymerase, 1989 1354, 1985 15 1234 56 78 9 X Původ hematoonkologických onemocnění ■ Systémová klonální onemocnění, vznik neregulovaným dělením jediné nádorově transformované buňky ■ nižší počet genetických změn nutných pro vznik, někdy stačí narušení kontroly buněčného dělení ■ změna zahrnující cca 10 6-10 7 bp se muže projevit bez viditelné změny morfologie chromozomu 17 Dělení hematoonkologických onemocnění A) Podle charakteru ■ Difúzni (leukémie) ■ Ložisková (lymf omy)-s nádorovými ložisky v lymfatické tkáni B) Podle postižené krevní vývojové řady ■ myeloidní prekurzorova buňka (CML nebo AML) -nádorová choroba vlastního krvetvorného systému ■ lymf oidní prekurzorova buňka (CLL nebo ALL nebo lymfomy) -nádorová onemocnění imunitního systému 18 Hematoonkologická diagnóza 1. Specifické markery pro daný typ/subtyp 2. Nespecifické (nezávislé) markery 3. Stratifikace podle rizika 4. Detekce oportunních patogenu 19 Proliferace granulocytu různého stupně maturace (CML) Janet D. Rowley, 1973 Chromozom 9 Chromozom 22 Fi la delfcký chromozom 3=HŕAeL P.C. Nowell, D. A. Hungerford, 1960 B2B genBCR 808 bp l 1 2 i i 12 b2(e13) b3(e14) 1 20 21 1 B23 typ b3a2 385 bp C5e- 1 11 12 13 14 2 3 T1 CA3-BCR-C type1a2 410 bp i 1 2 3 Jj CA3- Multiplex-PCR 1-kolo 2.kolo typ b3a2 . 11 | 12 I 13 | 14 I 2 | 3 I 4 i typ b3a2 ABL-2 i BCR-4 100x ředění v D.W. : 11 i 12 I 13 | 14 I 2 | 3 I 4 ■ ABL-3 BCR-5 Ďvoukolová nested-PCR Titrační ředění templátové cDNA 22 Titrační ředění kompetitoroveho templatu 23 Kompetitivní PCR a vyznačení bodů ekvivalence pacient kompetitor] JMa 1: Biotechnology (N Y). 1992 Apr;10(4):413-7. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. Roche Molecular Systems, Inc., Emeryville, CA 94608. We have enhanced the polymerase chain reaction (PCR) such that specific DNA sequences can be detected without opening the reaction tube. This enhancement requires the addition of ethidium bromide (EtBr) to a PCR. Since the fluorescence of EtBr increases in the presence of double-stranded (ds) DNA an increase in fluorescence in such a PCR indicates a positive amplification, which can be easily monitored externally. In fact, amplification can be continuously monitored in order to follow its progress. The ability to simultaneously amplify specific DNA sequences and detect the product of the amplification both simplifies and improves PCR and may facilitate its automation and more widespread use in the clinic or in other situations requiring high sample throughput. 1: Biotechnology (N Y). 1993 Sep; 11(9): 1026-30. Related Articles. Links Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Higuchi R. Fockler C. Dollinger G. Watson R. Roche Molecular Systems, Inc., Alameda, CA 94501. We describe a simple, quantitative assay for any amplifiable DNA sequence that uses a video camera to monitor multiple polymerase chain reactions (PCRs) simultaneously over the course of thermocycling. The video camera detects the accumulation of double-stranded DNA (dsDNA) in each PCR using the increase in the fluorescence of ethidium bromide (EtBr) that results from its binding duplex DNA. The kinetics of fluorescence accumulation during thermocycling are directly related to the starting number of DNA copies. The fewer cycles necessary to produce a detectable fluorescence, the greater the number of target sequences. Results obtained with this approach indicate that a kinetic approach to PCR analysis can quantitate DNA sensitively, selectively and over a large dynamic range. This approach also provides a means of determining the effect of different reaction conditions on the efficacy of the amplification and so can provide insight into fundamental PCR processes. 1: Nucleic Acids Res. 1993 Aug ll;21(16):3761-6. Related Articles, Links Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Lee LG. Connell CR. Bloch W. Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer, Foster City, CA 94404. Nick-translation PCR was performed with fluorogenic probes. Two probes were used: one complementary to a sequence containing the F508 codon of the normal human cystic fibrosis (CF) gene (wt DNA) and one complementary to a sequence containing the delta F508 three base pair deletion (mut DNA). Each probe contained a unique and spectrally resolvable fluorescent indicator dye at the 5' end and a common quencher dye attached to the seventh nucleotide from the 5' end. The F508/delta F508 site was located between the indicator and quencher. The probes were added at the start of a PCR containing mut DNA, wt DNA or heterozygous DNA and were degraded during thermal cycling. Although both probes were degraded, each probe generated fluorescence from its indicator dye only when the sequence between the indicator and quencher dyes was perfectly complementary to target. The identify of the target DNA could be determined from the post-PCR fluorescence emission spectrum. ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer/ABI) první dostupný RQ-PCR systém s laserem /l 996 Light Cyder (Roche Molecular Biochemicals) extrémní rychlost, kapiláry 5700SĎS (Perkin Elmer/ABI) halogen, CCĎ /l998 LightCycler (Roche) 7300 System (Applied Biosystems) SbS 5700 (Applied Biosystems) RotorGene 3000 (CorbettResearch) 26 RotorGene RS 3000 (CorbettResearch, Australia, cca 1 mil Kč) 27 1-1 1213141515171319202122 2324252527 2028 303132 33 34353037 33394041 CftU N um bei .; 'r. i: ■:■■::■: ijiiion ? Report ^ Vorwärís- Primcr 0 \®Q (T—^ - fr act D N apo lyiítói asi r. y dha sonde v _ 7$— DNA-ZielsetjLienz 5" «3" 0= Qu enclierfart) stoff R= Reporterforbstoff FR = Fluor edieren der Rep o rferfarbsioff RiichiAiárts-Prínicr Standard Curve 34 +, 32 \ 30 + 28 ?26 24 22 * 20 18 + 5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 ; 7 Log CO Slope: -3.778070 Intercept: -14.51 BGBl Correlation: 0.SSSSG8 [p^i 3 28 ůt ' PCH praíKi tum atit lil I. Blunt-*ad chmÍKi ní f C* product ^ lo "jfcb jnd icrppninq a1 chnu nn tt cnrvflpjpd in ja litth li 'JA liMFX «ling 1Ďp ĽnpyťnnEraL™ IjI:H 5í*>w by «on« 9*1 ^ías* na;S 'ttaiG r" ■---------■ r-, ^ řp?Í3 T2 —i i—i řfcoRI íí-jíi: /' '«MU PSAK1Í7 vc^í^ Příprava standardní DNA - klonování PCR produktu do plazmidoveho vektoru - transfekce plazmidu do E.coli - izolace namnožené plazmidové DNA -vytvoření ředící řady o známém počtu kopií sledovaného genu Gelová elektroforéza specifického PCR produktu po rozklonování a vložení do E.coli 30 , i ii^'.-iai I^VI v ' ' tí 1_| "■' ■^'_tl I .i. C? a |..ii_iü lailIP. y rUU^jJÚQL 3 e 100% © ^ S5 Control Gene Standards: Product Riefe rance Name GGRŮ-01 ABL GGRŮ-02 B2M GGRŮ-03 GUS GGRŮ-04 TBP Fusion Gene Standards: Product Reference Hune FGRS-01 AML1-ETO FGR6-Ü2 CBFB-MYH11 A FGR6-Ü3 CBFB-MYH11 D FGR6-Ü4 CBFB-MYH11 E FGR6-Ü5 PML-RARA bcrl FGR6-0Ě PML-RARA bcrí FGR6-Ü7 PML-RARA bcr3 FGHS-OS E2A-PBX1 FGRS-09 BGR-ABL e1 ai m-bcr FGR6-10 BGR-ABL b3a2 M-bcr FGR6-11 TEL-AM LI e4e11 FGRS-12 SIL-TAL FGR6-13 MLL-AF4e10a4=HS411 type FGR6-14 MLL-AF4 e9e5 = MV411 type FGRS-15 MLL-AF4 e1186 = ALL-PO typa FGR6-1Ě MLL-AF9 typa A FGR6-17 MLL-AF9 type B FGRS-1S MLL-AFĚ FGB6-19 MLL-DUP FGR6-20 New MLL-ENL ex9 FGB6-21 New MLL-ENL exit) FGR6-22 New MLL-ENL exil FGR6-23 New MLL-AF9 ex9 FGR6-24 New MLL-ELL ax9 FGB6-25 New MLL-ELL ax10 FGR6-2Ě New MLL-AFIp axil Bibliography I.J. Qabertet d. SrandardzaUcnand quBlrycontrolLlLKifee.d ■imJ-taiB" quantrlaoVe r?-íľ.í IranscitplasepoNTnerasecnari reaction (RQ-PCRioMLElongene transcript tor .Tiřtnal restual cbease detection In leukeula - A Buope AgahEi Cancer Frograr. In PreeEi LeJomte. 2. E. Ballard at al. EoalLjalon or canddata control genes for dagnosfc AML M2 s AMLl/ETO (53 let) %EXPRESE RI 3.K 2.RI DNY CYTOGENETIKA MYELOGRAM FLOWCYTOMET. DNY 0 49 88 126 152 172 180 214 250 272 285 348 388 %EXP.- BM 149 11,74 21,77 0,00003 0,03 0,04 0,02 0,09 12,68 74 204 127 133 %EXP.- PB 42 AML M5 s CBFß/MYHll (61 let) %EXPRESE S1DNY CYTOGENETIKA MYELOGRAM FLOWCYTOMET. DEN o 112 268 280 290 322 360 402 448 483 511 541 560 597 645 %EXP.- BM 130 0,18 3,54 25,41 54,92 115 1,97 0 0,025 0,007 0,15 6,3 0,38 0,16 %EXP.- PB 0,05 0,27 6,07 35,96 %EXPRESE 252 AML M2 s AMLl/ETO (27 let) 3.K DNY S1 CYTOGENETIKA MYELOGRAM FLOWCYTOMET. DNY I 0 23 62 99 118 160 198 232 241 289 %EXP.- BmI 252 1,19 0,0013 0,001 0 0 0,008 0,39 0,97 0,015 %EXP.- Pb| 0,74 0 0 0,01 %EXPRESE AML MO s MLL/AF9 (26 let) l.K aTx T BflJY CYTOGENETIKA MYELOGRAM FLOWCYTOMET. DNY 0 33 62 96 105 138 175 182 201 %EXP.- BM 60 73,98 27,49 0,02 0,07 0,07 0 %EXP.- PB 18,69 0 0,02 0 0 0 ABI i«řfen!.ni PRISM ]) P Detekce buněčného chimérismu po HSCT HBI IGilOZD/ lij ZGitfflV □Q ■■ 1R:102D/ ZR:102P/ Dye/Samrjlt Minulet Size Peak Height Peak Area Data) IG, 61 15.90 182.19 73b3 584Q1 1G.64 16.31) 196.SU 6665 53936 i 2G.63 IS.97 189.93 6882 iübii J ?G,65 16-19 196.77 6708 51503 ABI A. PRISM GeneScanM.1 M Paoeiod 5' primer =000000000— 3' primer STR 5' primer =00000000000-= 3' primer 5' primer ,, 3 primer VNTR 5^ primer___,,________ __ __ 3' primer Pagel rjM HBI 3G : 102D * 11 OD / BDI 8G:102^2D/ BBI 2G:102-48D t 99Par/ HBI 6fi : 102-1 5 40 / BB 3 R : 102D . 11 OD / I 8R:102-42D/ □ □ Sft : 102 ISO i 99Par> BB fift : 10?'l 54Í1 / Oye/Sample Peak 3G. 42 3Ľ 4-1 8S, 93 SG. 9-1 sn. 9 9 2G, 1 5 2G, 20 _6G,__50_ 6G. 51 Minutes IS.02 lfi.?S 15.91 16.14 Size 189.53 196.49 1 SI 90 10;. Iii. Peak Height 7134 419 5125 6530 GP70 Peak Area 3164 37007 47401 449C0 4368 4472 4401 4533 Hematologický relaps-příklad monitorovaní pacientu po HSCT VH 154 dní o 1.10.2002 clenO 19.4.2003 5.11.2003 23.5.2004 9.12.2004 Odběr FA RQ-PCR 1.8.2006 FA Detekce bodových mutací c Skngle-slranded DNA T wiin unknown sequence (Blue) G 6flf ve3 as a template T + ONA polymerase C * iIATP.dCTP, ÖTTP. arxlllQTP a Hadioacüvely labeled primer Přeper« rour raeciion miíiures i-ddATP -i-ddCTP +ddTTP +döGTP Gel elect raphores is (allowed By autoradiography --- O and n er«) A deduce sequence C sequence of new T of ----- slrorx) G template " A -----* A O C JU Detekce mutací metodou f ragmentační analýza CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter,CA) iDGrHf^l^if | Dl|| D2|H Dj|| fĎTj MJy Height |68789.29 -j-j X Width |6Ö~ |cZ3 Study ■■Íj7 Fragments List ■Jf Results Set *l » Stacked Graph HRE Analyses "j Data } Reports J iReady 294.987,57828.412 60000 -= rö 50000 -| §i 40000 -| CD 30000 -I J, 20000 Q 10000 0 -E- 292.13 1.C11 070815126H 296.95 27Ü.782, 186738.133 200000 -|~ rö 150000 -E CG 100000 ^ 50000 0 2.D11 070815126H 279.669. 109614.797 _ 100000 -r c 75000 -I ™ 50000 -E q 25000 0 293.Ü3 3 Ell 07081512GJ 296.334.77247.358 70000 -I _ 60000 -I c 50000 -| 40000 -| 30000 -| >> 20000 -f D 10000 0 i CG 270 280 lí 290 Size (nt) 300 310 320 ~±J Detekce mutace V617F JAK-2 metodou alelické diskriminace 3) RQ - PCR izolace DNA RQ - PCR s využitím fluorescenčně značených LNA modifikovaných hybridizačních sond (Locked Nucleic Acids) vyznačují se 100% alelickou diskriminací obou genotypů citlivost detekující 10% příměs granulocytů nesoucích mutantní alelu r\a pozadí zdravé populace fluorescenční značení FAM pro sondu s WT sekvencí a JOE pro sondu s MUT sekvencí 40 RQ - PCR ar\a\ýza Norm. Fluoro. 0,8 Cycling A.FAM/Sybr - No Markers Cycling A.JOE-Circles JZJ—&--Í—*—*—*—* g_- *l~~o c—*—-Í OR -----~~~ }—*~-*—*—-C—-j—_g_ 0,4 y^ ^**\ 0,2 / y/ // 0 Threshold J*' ^^ 0 '5 10 15 20 25 '30 '35 40 '45 '50 Cycle Amplif ikační křivky plasmidu wt a mutant V617F 41 Pacient - wt Pacient -heterozygot Pacient - mut. homozygot - PCR analýza Cycle 'O '5 '10 '15 '20 '25 '30 '35 '40 '45 '50 Cycle Akutní myeloidní leukémie heterogenní skupina onemocnění různé chromozomální aberace 40-50% případu AML s molekulárním markerem acute myeloid leukaemia random AMLl-ETO t(8;21) CBFp-MYH inv(l NUP98-HÖXA9 tC7;ll) FUS-ERG t(16;21) DEK-CAN MLL-AF9 PML-RARa J*" NPM-MLF1 t(6;9) t(9;ll) PLZF-RARa tU'Vj t(3;5) NPM-RARa t{15;17),t(ll;17),t(5;17) 43 Prognostické faktory AML ■ Fúzní geny s diagnostickým významem - PML/RARa ® dobrá prognóza - AML1/ETO ® dobrá prognóza - CBFb/MYH ® dobrá prognóza - přestavby MLL genu ® špatná prognóza ■ změny genu s prognostickým významem - interní tandemové duplikace ITD-FLT3 genu - bodové mutace aktivační smyčky FLT3 genu - mutace CEBPa genu, parciální tandemové duplikace MLL genu 44 Rozšiřování spektra molekulárních markeru v pozici nezávislých prognostických faktorů - snaha o prognostickou stratifikaci leukemických pacientů a sledování minimální residuální choroby i u pacientů s normálním karyotypem : (AML 40-50%!) gen NPM-1 mutace, příznivá prognóza gen FLT3/ITĎ a FLT3/Ď835 : negativní prognóza (AML) gen WT-1 , tumor-supresor gen na llplS, zvýšená exprese negativní prognóza (akutní leukémie a MĎS) mutace v genu pro myeloidní transkripční faktor CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein-alfa): je zahrnut v neutrofilní diferenciaci, příznivá prognóza (myeloblastická AML, Ml a M2) gen BAALC (brain and acute leukemia, cytoplasmic): 8q22.3, progenitorove buňky, vysoká exprese negativní prognóza (AML a CML pouze BC) aktivující bodová mutace v genu JAKŽ V617F (Janus kinases) nepříznivá prognóza (cMPĎ-PV, také AML M6 a M7) FLT3 (FMS-like tyrosine kinase)____________STKl (Stem cell kinase 1) flk2 (Fetal liver kinase2) lokalizace 13ql2 je členem rodiny receptorových tyrozinových kináz, exprimován na hematopoetických kmenových buňkách a také na buňkách leukemických. Mutace dvou typů popsány: 1) délkové v JM doméně (ITĎ, interní tandemové duplikace části genu) v exonu 14 (příp. 15) 2) mutace v katalytické doméně TKĎ, kde kodóny Ď835 a 1836 jsou kódovány nt GATATC, tvořící reštrikční místo pro EcoRV (FLT3/Ď855) Mutace jsou detekovány u ~30% AML s normálním karyotypem, představují nepříznivou prognózu často jsou považovány za sekundární aberaci a nejsou stabilní v průběhu follow-up. FLT3 Mutations in AML TK2 K1 Internal tandem duplication (FĹT3HJD) Point mutation in activation Loop (FĹT3ÍTKD) TK2 Asp835, II6836 46 RT-PCR detekce interních tandemových duplikací v exonu 12 genu FLT3 R5: 5' -TGTCGAGCAGTACTCTAAACATG-Z' 12R: 5' -CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-V, PCR produkt 456 bp Kiyoi, H. et al., Leukemia, 11, 1447-1452, 1997 47 Reštrikční analýza - Detekce mutací D835 v katalytické doméně TKĎ v exonu 20 (17) genu FLT3 ^\r\T\rv^ JM TKi TK2 Ejujo 17 K D I K CGAGATATCATG b» t>p KcoRV »I« -46 bp- 11 Li B M wild Mt t>p 114 «t 4fi Figure 1. Detectior of D635 mutations in the FĹT3 gene, To detect D835 mutations, we amplified exon 17 by PCR, and then digested it with the EccR\' endonuclease (A). The amplified products of wild type were digested to 2 bands {68 bp and 46 bp) by the EcoRV. When amplified products contained D835 mutations, undigested bands (114 bp} were visualized on agarose gel electrophoresis. M indicates the molecular weight marker (Haetll digested pBR332 plasmid DNA) (B). The undigested bands were directly sequenced (C). In this sample, the first nucleotide G of DB35 was substituted with T, resulting in an Asp to Tyr amino acid change (D835Y). Yamamoto, Y., et al., Blood, 97, 2434-2439, 2001 48 DUň (a] DNA is denatured by heating lb] (c) ((]) Rensturatior an cooling RH A strano dma strana http://www.accesseKcellence.Drg/AB/GG/nucleic.html Nucleic Rcid Hybridization Ethidium bromide-stained agarose gel • i--—. 32P probe 49 A. RNA Isolation E. imaging TOCTTJCCGG AAOK-TTJS: GOCCCOOCAG GAACAADCOC ií3ACJĽ!tľATC TTTiCGTOCT CČŮCChkCŮAC 'KUCCA'ľKÍ 0GOGCÖCAÄC GTCOGAATDtl TťTATOCTCC CTATAGCGAG TOCCOCTAAT «CTACCTX erraoocccíL iocvmcTiů- CŮC-COCCTCT CCGŮfiAGOŮÍ CTCTDOKAC GiCAGGGCTT T3GCTTGCCC cnoGcnoocA ATTAACKWCC 0GTCA3GACC GJtTACTTAT TdOTCŮOC-Ai TÜGATÄOCTTC TAA3CCTCTC TGCCJĽCATT ŤTťŮŮíMTGA AACrtTTITOOG CACAGTTTCA TTGiOGCAAC-CTT3AÜCTCA ŮAASTCJJJkíT TGTETCADOG GGZATZKAT AJATCGCKT iöSGCTÜTTC cnoocinTAT CAGAAGGATT CGCGCCTTCG T7TAACATCC OOŮÍJJkOC-ŮC D. Hybridization to Array CLL Oligonukleotidové DNA čipy pro stanovení exprese > 19.000 genů Geny s největšími rozdíly v expresi mezi CLL pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH C0BLL1 ssep: PPI'lPf-A LIIPBI LIÍPB2 TF-53111 cd": MEST 3EC11L3 phe?; tfst: lhpp FLD1 LÜC4Ü0451 ĽLCCI1 GffAZ I LPI S100A2 HAPK4 VEB^ FLJÍOfT* AHEM^S FAP.Í1 DFB) KLEI USPIC ZAP70 ZAP70 ZAP7Ü ZAP70 ZAP7Ü ZAP70 :ři,to ZAP70 ZAP70 2AP70 DBCCR1L U&T2B15 AFBBľ 1115 CK1FSF7 ÍD-Sep ÄTP1B3 10-Sep S1CŮA4 GPJI C5cĽf4 THEM33A Ĺ AG 3 p:r>:i DPYD PRICKLEI DFHA5 BD ITMl TOPES FlÁ 51 LymfoChip Olígonukleotídove DNA čipy s 15.000 sondami pro 4.000 genu Až 8 pacientu na jednom čipu Geny s rozdílnou expresí u pacientů s Folikulárním lymf omem a ĎLBCL nebo Burkittovým lymf omem ArrayCGH Oligonukleotidové DNA čipy >40.000 sond rovnoměrně pokrývajících všechny chromozomy ri_55 SM iijJÜ S y=_j Jdi. g ^ HWlutfl n Efc ! Iltl * M°«W|«^|2!^Sft££I2^S^SŕJ,,,H' .*Jím«m *jim*m -r^-up^ä .^..rt.^ta «,aj«w -*j» -----------------------------1 «*.. i----------|—H—I |. I-----i„. ,.»,—.■ I.-,.., Různý rozsah delece krátkého raménka chromozomu 17 u dvou pacientů s CLL - v prvním případě jde o deleci celého raménka, ve druhém o deleci úseku o velikosti asi 1,2 Mb Oo CML treatment in the Genomic analysis (clattifJcíilton ami response) Im.it in i h responsive limitinih wm: ;llu\i -W MRI) monitoring "Ilí-rísk^of rclap&e Bcr-aW lime 433773 New inhibitory molecules Abl kinase inhibitors - AMN 107 (Novartis Pharma) Abl/Src inhibitore - Dasatinib (Bristol Myers Squibb) - AP23464 {Ariad Pharmaceuticals) - SKI-6Ü6 {Wyeth-Ayerst) - AZD-0530 {Astra-Zeneca) - Pyridopyrimidines (PD family, Pfizer) Abl/Lyn inhibitor- NS-187 (Nippon Shinyaku} Abl substrate inhibitor - ON 0; oint mutations \n the Abl kinase domain 0 0 Phosphate ivation loop H 396 Catalytic After Ohvashiki et al, 2004 Nástup nových terapeutických možností přináší obrovské úspechy... Mutace v ABL kinázové doméně Kinázová doména ABL: zahrnuje aminokyseliny 220-498 • Mutace v oblasti P-loop: - způsobují změnu konformace, vedou k aktivní konformaci, Špatná prognóza, G250E, Q252H, E255K • T315I mutace: vodíková vazba s imatinibem, allosterické působení na vazbu léku • Mutace katalytické oblasti: - M351T mutace: destabilizace autoinhibiční konformace Abl, porušením vazby s SH2, F359C • Mutace v oblasti A-loop: - zabraňují dostat se do „vypnutého" stavu. F382L. H396R_________ Schéma struktury Abl kinázové domény Detekce bodových mutací Amplifikace BCR-ABL Expand High Fidelity Enzyme (Roche) Primery F-BCR-A (exon el2/el3) x R-ABL-A (exon a8) typ b3a2 R-ABL-A i e11 | e12 | e13 | e141 a2 I a3| i a8 | a9 i => F-BCR-A Sekvenace oblasti exonů a4-a8 na AbiPrism 310 sekvenátoru za použití primeru ABL-ALT a BigDye®Terminator vl.l Seq.kit Srovnání získaných sekvencí se standardními sekvencemi X16416 Název primeru Sekvence 5'-> 3' ABL-ALT* 5-GCG CAA CAA GCC CAC TGT CTA TOGS' F-BCR-A* 5-GAG C AG CAG AAG AAG TGT TTC AGA-3' R-ABL-A 5-CTC TAG CAG CTC ATA CAC CTG GG-3' Gorre M.E. et al. 2001 Science*, Soverini S. et al. 2004 Clin.Chem.* Vývoj mutace u pacienta rezistentního na imatinib s mutací Met351Thr ATG->ACG X1/03' T/C VI/04' C/T 3Í0 C A G C C A T G 3Ě0 G A G T A yk. / \l C A G C C 370 G A G T A 111/05' C C A G C C A C G 360 G A G T A WU J h rok léčby: pouze bez cytogenetické hematologická remise remise akcelerace nemoci 58 ôranulocyty a erytroblasty (BM normal)