Metody molekulární patologie Místo molekulárně biologických metod v patologii: Schéma diagnostického postupu Molekulárně biologické metody: ÚPA FN Brno • analýza proteinů - imunobloting - isoelektrická fokusace a dvourozměrná elektroforéza • analýza DNA (gDNA, cDNA)/RNA - FISH - PCR - kombinace PCR s metodami k určení bodových mutací: sekvenování, SSCP, heteroduplexní analýza, DGGE, … • analýza nádorového supresoru p53 - FASAY • stanovení chemorezistence nádorů in vitro Imunobloting Imunohistochemická analýza • přítomnost /a hladina proteinu • lokalizace proteinu v buňce (jádro, cytoplasma, vazba na membránu, …) • počet/podíl pozitivních buněk • výchozí materiál: formol-parafinový bloček Imunobloting • detekce aberantních (např. zkrácených) forem proteinů /hladiny proteinů • výchozí materiál: čerstvě odebraná/zamražená tkáň Příklad využití imunoblotingu: analýza svalových proteinů Mezi svalová onemocnění – myopatie – patří svalové dystrofie. Dystrofin je tyčinkovitý cytoskeletální protein umístěný na vnitřní straně buněčné membrány – sarkolemy. Mutace v dystrofinovém genu jsou základem dystrofinopatií. Dystrofin-glykoproteinový komplex (DGC) zahrnuje: merosin, α- a β-dystroglykan, calpain. (calpainopatie), α-, β-,γ- a δ-sarkoglykan. Provedení imunoblotingu • příprava proteinových lyzátů z vyšetřované tkáně • změření koncentrace proteinů (standardizace) metodou Bradfordové, barvením CBB • elektroforetické rozdělení proteinů metodou SDS-PAGE • westernový přenos • detekce specifických proteinů pomocí protilátek Uložení zamražených tkání Princip SDS-PAGE Elektroforetické rozdělení proteinů dle Laemmliho Westernový přenos a detekce proteinu pomocí protilátky ELFO: nalévání gelů ELFO: nanášení vzorků ELFO: separace proteinů Barvení proteinů Comassie Brilliant Blue Westernový přenos Imunobloting dystrofinu Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Hybridizace • tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a komplementárních molekul nukleových kyselin • založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA FISH: deparafinizace vzorků FISH: natrávení preparátů proteázou, fixace, dehydratace FISH: hybridizace sondy FISH: fluorescenční mikroskop LEICA FISH: fluorescenční mikroskop Nikon Využití FISH • /Detekce přítomnosti cizorodé (virové) DNA v lidských buňkách/ • Detekce změn v počtu celých chromozomů (3) • Detekce amplifikace genů (2) • Detekce translokace chromozomů (1) FISH 1: Detekce translokace chromozomů • Pro detekci se použijí dvě sondy značené odlišnými fluorescenčními barvami. Každá sonda se váže k sekvenci jednoho z genů. • Pokud je přítomný fúzní gen, vznikne směsný signál v důsledku fluorescence sond navázaných v těsném sousedství. • Většinou je translokována pouze jedna alela, proto lze vedle pozitivního signálu zachytit i samostatné signály obou sond. Detekce translokace chromozomů Příklady • t(14;18) u folikulárního lymfomu • t(8;14) u Burkittova lymfomu • t(11;14) u Mantle Cell lymfomu • t(9;22) u chronické lymfoidní leukémie Detekce translokace chromozomů Detekce translokace chromozomů FISH 2: Detekce amplifikace genu • Sonda specifická pro sledovaný gen (nebo pro sledovaný gen spolu s centromerickou sondou daného chromozomu). • Určuje se počet signálů (nebo poměr signálů sledovaného genu a signálů odpovídajících počtu centromer = chromozomů). • Např. amplifikace genu myc u neuroblastomů nebo genu c-erbB2 u nádorů prsu. Detekce amplifikace genu Detekce amplifikace genu HER2/neu FISH 3: Detekce změn v počtu celých chromozomů • Jako sondy se používají směsi krátkých fragmentů pokrývajících celé chromozomy nebo fragmenty specifické pro dané chromozomy, například centromerické sondy. • Podle počtu signálů stanovených mikroskopií lze určit, kolik kopií daného chromozomu se v buňkách nachází. Detekce trizomie chromozomu 8 u nemocného s AML (použita centromerická sonda pro chromozom 8) UroVysion UroVysion Polymerázová řetězová reakce - PCR • Dnes klíčová metoda užívaná v molekulární diagnostice. • Podstatou je amplifikace krátkého úseku DNA (řádově stovky až tisíce bází) ohraničeného syntetickými oligonukleotidy specifickými pouze pro analyzovaný úsek genu. • Používají se termostabilní DNA polymerázy, které odolávají teplotám, při nichž DNA denaturuje. Polymerázová řetězová reakce - PCR Syntéza DNA probíhá formou cyklů (v termocyklerech), při nichž se v závislosti na teplotě reakční směsi pravidelně střídají tři kroky: • denaturace dvouřetězcových molekul DNA (94 – 98°C) • připojení primerů k odděleným DNA řetězcům (30 – 65°C) • polymerační reakce (65 – 75°C) Příklad jednoho cyklu PCR Exponenciální nárůst produktu PCR Varianty PCR • RT-PCR: zpětná (reverzní) PCR – je určena k amplifikaci mRNA, která se nejdříve přepíše reverzní transkriptázou do komplementární DNA (cDNA) • Kvantitativní PCR – umožňuje přímou kvantifikaci produktu PCR (např. při detekci minimální zbytkové nemoci) - kompetitivní PCR - PCR sledovaná v reálném čase • PCR in situ - lze následně kombinovat s FISH Varianty PCR • Nested PCR – dvě kola PCR s dvěma sadami primerů (zvýšení specifity, případně účinnosti reakce) • Multiplex PCR – v jediném kroku více sad primerů (např. současná analýza více exonů téhož genu nebo současná analýza více možných typů fúzních partnerů jednoho genu – např. gen MLL) – podmínkou je podobná teplota připojení primerů k jejich specifickým sekvencím Provedení PCR • izolace RNA; syntéza cDNA (RT-PCR) • sestavení PCR reakce ve zkumavce: DNA (gDNA, cDNA) primery pufr (hořečnaté ionty) nukleotidy DNA polymeráza • umístění zkumavky do termocykleru: 35 cyklů • elektroforetická analýza produktu PCR • další analýza produktu PCR PCR: termocykler Detekce DNA po elektroforéze (EtBr – UV světlo) Funkční analýza nádorového supresoru p53 • Vrozené mutace p53 jsou velmi vzácné, ale spojeny s vysokým rizikem vývoje nádorů. • Asi 50% všech nádorů má (somatickou) mutaci v genu pro p53. • Mutace genu p53 je prognostickým / prediktivním markerem u některých diagnóz (CLL). Schéma FASAY funkční analýza separovaných alel v kvasinkách (yeast) FASAY dokáže detekovat částečně inaktivní mutace p53 Testování chemorezistencí nádorů in vitro • Individualizace terapie se v medicíně již uplatňuje (baktérie – antibiotikum). • Pozitivní odpověď i na statisticky nejefektivnější léčbu nádorů vykazuje pouze část nemocných. • Možnost testování citlivosti/rezistence nádorových explantátů k cytostatikům in vitro. Smyslem je eliminace neúčinných preparátů. Mechanické rozrušení tkáně Mechanické rozrušení tkáně Rozdělení suspenze buněk na malé alikvoty Kultivace buněčných explantátů s testovanými cytostatiky „MTT test“ – vyhodnocení viability kultivovaných buněk • Podstatou je měření celkové aktivity mitochondriálních dehydrogenáz. Ta koreluje s počtem metabolicky aktivních buněk v kultuře. • Ke kultuře se přidá některý typ tetrazoliových solí (např. MTT, WST-1), které jsou dehydrogenázami štěpeny na barevný formazan. • Množství formazanu lze vyhodnotit spektrofotometricky. • Koncentrace formazanu je nepřímo úměrná účinnosti cytostatika. „MTT test“ – vyhodnocení viability kultivovaných buněk Přežití se počítá v procentech – oproti kontrole rostoucí bez cytostatika, s korekcí na čisté růstové médium. Na 96 jamkové destičce je • čisté médium • negativní kontrola • pro každé cytostatikum dvě sestupné řady koncentrací od toxické pro zdravou tkáň až po koncentraci pro zdravou tkáň víceméně neškodnou • případně barevná kontrola pro dané cytostatikum Měření absorbance s využitím ELISA readeru Hodnocení výsledků • výsledky se hodnotí s využitím programu Chemorezist • převedení dat do křivek přežití: x = koncentrace cytostatika; y = procento přežívajících buněk • koncentrace cytostatika, při níž přežívá 50% buněk = EC50 • EC50 < 1/16 max. koncentrace ~ citlivá tkáň • EC50 = 1/16 až ݙax.k. ~ spíše rezistentní tkáň • EC50 > ݙax.k. a více ~ rezistentní • podíl rezistentních buněk, které přežívají při maximální koncentraci cytostatika Spektrum metod používaných v laboratoři molekulární patologie