Základy klinické cytogenetiky – chromosomy Hanáková M. SHRNUTÍ PŘEDNÁŠKY • chromosomy • metody přípravy chromosomových preparátů, hodnocení chromosomů, metody molekulární cytogenetiky • vrozené chromosomové aberace • onkocytogenetika DEFINICE A HISTORIE • klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromosomů (jejich počtem a morfologií) a vztahem mezi nálezy chromosomových aberací a fenotypovými projevy. • vznik moderní lidské cytogenetiky se datuje od roku 1956, kdy byly vyvinuty efektivní metodiky chromosomální analýzy a bylo stanoveno, že normální počet lidských chromosomů je 46. SCHEMA ŽIVOČIŠNÉ BUŇKY buněčné jádro DEFINICE KLINICKÉ CYTOGENETIKY • klinická cytogenetika zabývá se analýzou chromosomů - počtem - morfologií - vztahem mezi nálezy chromosomových změn a fenotypovými projevy JADERNÝ MATERIÁL • chromatin – komplex DNA s chromosomovými proteiny (pojem používaný pro interfázi, kdy se většina chromatinu nachází v rozvolněném stavu) • chromosom – chromatin spiralizovaný v mitóze (mitóza proces dělení buňky, při kterém dochází k rozdělení genetického materiálu mezi 2 dceřinné buňky) CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromosomů během buněčného cyklu se chromatin nachází v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký stupeň spiralizace, během mitózy postupná kondenzace, maximální v metafázi mitózy) CHROMOSOM tyčinková struktura CHROMOSOMY V PRAXI CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp • soubor chromosomů jedince nebo buňky s označením jejich počtu, druhu pohlavních chromosomů a případných aberací • lidský karyotyp se skládá ze 46 chromosomů, z toho 22 párů autosomů (nepohlavních chromosomů) a 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) • chromosomový pár je tvořen homologními chromosomy, z nichž jeden je zděděn od otce a druhý od matky, nepárové chromosomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) ZÁPIS KARYOTYPU 46,XX - normální ženský karyotyp 46,XY - normální mužský karyotyp CHROMOSOMY V PRAXI normální karyotyp CHROMOSOMY V PRAXI odběr materiálu Odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) • do heparinu a transportního média – kostní dřeň (obv. 1-2 ml) • do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda (obv. 20 ml) CHROMOSOMY V PRAXI odběr materiálu CHROMOSOMY V PRAXI kultivace materiálu CHROMOSOMY V PRAXI zpracování suspenze • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - zastavení dělení buněk v mitóze jaderný materiál zůstane spiralizován ve formě chromosomů, které jsou vhodné k analýze CHROMOSOMY V PRAXI zpracování suspenze vykapání suspenze na sklíčka CHROMOSOMY V PRAXI pruhování chromosomů metody klasické cytogenetiky pruhování chromosomů analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů CHROMOSOMY V PRAXI pruhování chromosomů metody klasické cytogenetiky G – pruhování chromosomu č. 1 – vzor a reálný chromosom CHROMOSOMY V PRAXI hodnocení metody klasické cytogenetiky chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení přibližně 1250x za použití imersních objektivů CHROMOSOMY V PRAXI hodnocení metody klasické cytogenetiky světelný mikroskop s CCD kamerou napojený na počítač CHROMOSOMY V PRAXI hodnocení metody klasické cytogenetiky karyotyp sestavený na počítačovém programu Lucia CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (ABERACE) • vrozené chromosomové aberace (VCA) (vyšetření karyotypu) – početní - strukturní Klinické indikace k postnatálnímu stanovení karyotypu (VCA) • problémy časného růstu a vývoje neprospívání, opoždění vývoje, dysmorfická facies, mnohočetné malformace, malá postava, obojetný genitál, mentální retardace • narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence výskyt chromosomových abnormalit je vyšší u případů narození mrtvého plodu (téměř 10%) než u živě narozených dětí (asi 0,7%), zvýšený výskyt také u dětí, které umírají v novorozeneckém období (okolo 10%) • problémy s fertilitou ženy s amenoreou, infertilní páry, opakované spontánní aborty, partneři před IVF • rodinná anamnéza známá nebo suspektní chromosomová abnormalita u příbuzných • dárci gamet, děti k adopci VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) • významně se podílejí na mnoha případech poruch reprodukce, vrozených malformací, mentálních retardací • cytogenetické poruchy jsou přítomny přibližně u 1% živě narozených dětí VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů • abnormality počtu chromosomů - aneuploidie – nejčastější a klinicky velmi významný typ chromosomových poruch - abnormality počtu chromosomů v páru - tento stav je vždy spojen s poruchou fyzického nebo mentálního vývoje VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie • trisomie – nejčastější porucha (přítomnost nadbytečného chromosomu v páru) trisomie autosomů - (trisomie celého chromosomu je jen vzácně slučitelná se životem) - Downův syndrom 47,XX,+21 (47,XY,+21) - Edwardsův syndrom 47,XX,+18 (47,XY,+18) - Patauův syndrom 47,XX,+13 (47,XY,+13) trisomie gonosomů - (fenotypové důsledky jsou méně závažné než u trisomie autosomů) - Klinefelterův syndrom 47,XXY (muž) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Downův, Edwardsův a Patauův syndrom Downův syndrom 47, XX, +21 VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Klinefelterův syndrom Klinefelterův syndrom 47,XXY VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie • monosomie – méně častá porucha (chybění 1 chromosomu v páru) - monosomie gonosomu X (Turnerův syndrom) 45,X (žena), častý výskyt VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • strukturní abnormality chromosomů • méně časté než aneuploidie • dochází k přestavbám a následně ke změnám morfologie chromosomů • předpokladem je vznik zlomů na chromosomech VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace • balancované přestavby - v sadě chromosomů je zachováno normální množství chromosomového materiálu (žádný materiál nechybí ani nepřebývá) - většinou nemají fenotypové vyjádření (nejsou přítomny poruchy fyzického nebo mentálního vývoje), v buňkách je přítomen veškerý chromosomový materiál, i když v odlišném uspořádání • nebalancované přestavby – část chromosomového materiálu v karyotypu chybí (parciální, částečná monosomie) a část přebývá (parciální trisomie) - většinou dochází k fenotypovým abnormalitám VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, balancované translokace • translokace – nejčastější ze strukturních aberací, předpokladem je vznik dvou zlomů, každý na jednom chromosomu VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace translokace u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a s tím souvisejících potratů nebo narození potomků s nebalancovaným karyotypem (parciální monosomie jednoho a parciální trisomie druhého chromosomu) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace 46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, balancované inverze • inverze – na jednom chromosomu vzniknou 2 zlomy, segment mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení do chromosomu VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, nebalancované delece • delece – vznik zlomů a ztráta úseku chromosomu, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální monosomie) ZÁPIS KARYOTYPU 46,XX,inv(1) Metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • molekulární cytogenetika aplikuje metody molekulární biologie na cytogenetické úrovni, vizualizuje a lokalizuje genetický materiál v buňkách • pracuje s metafázními chromosomy nebo interfázními jádry • potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky (metody klasické cytogenetiky – základní vyšetřovací metody, metody molekulární cytogenetiky – metody s vyšší rozlišovací schopností) • začátek rozvoje – přelom 60.- 70. let 20. století METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování (před použitím metod molekulární cytogenetiky je třeba vědět, co chceme hledat – při klasickém karyotypování vidíme karyotyp jako celek za nízkou cenu, vysoká cena molekulárně cytogenetických metod) • oblasti uplatnění FISH – klinická cytogenetika (postnatální vyšetření u sterilních párů, postižených dětí a dospělých s podezřením na genetickou příčinu onemocnění, genetická analýza pro účely umělého oplodnění, prenatální diagnostika karyotypu plodu) - nádorová cytogenetika - výzkum (evoluční studie karyotypu, mapování genomu ...) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – ISH (in situ hybridizace) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) (FISH = nejpoužívanější typ ISH) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • vyhodnocení a zpracování signálu – FISH - fluorescenční mikroskop napojený na počítač – vizualizace a kvantifikace (signál září v tmavém poli) – modrá barvička (DAPI) obarvuje všechny chromosomy, červený signál = fluorescenčně značená sonda METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH • složitější metody, které vypovídají o genetickém materiálu v celém karyotypu (nejen o jednotlivých specifických úsecích) • pracují se směsí sond, která je specificky připravená pro danou metodu METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) zeleně označeny úseky na chromosomech, které jsou v karyotypu maligního klonu zmnoženy, červeně označeny chybějící úseky chromozomů (obrázky převzaty z internetu) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) SKY – mitóza po hybridizaci se směsí sond značených fluorochromy METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – m-BAND (mnohobarevné pruhování) přestavby v rámci jednoho chromosomu (inverze, delece) Nádorová cytogenetika ONKOCYTOGENETIKA základy • zhoubné bujení je genetické onemocnění • vznik nádoru (maligní transformace) je mnohastupňový proces – sled genetických změn – mutace genů řídících buněčné dělení, růst a diferenciaci, buněčný zánik, reparaci DNA, přestavby na úrovni chromosomů a genomu, narušení integrity genomu (defekty v genech zajišťujících chromosomovou stabilitu a přesný rozchod chromosomů v mitóze) • maligní buňky mají během vývoje nádoru tendenci akumulovat chromosomové abnormality ONKOCYTOGENETIKA základy • vyšetření karyotypu maligních klonů z kostní dřeně (klon – skupina buněk se stejnými genetickými změnami) • vyšetření metodami klasické cytogenetiky (G-pruhování) • vyšetření metodami molekulární cytogenetiky (FISH, SKY, CGH, mBAND..) ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn • chromosomové změny – početní - chybění nebo nadbytek jednotlivých chromosomů – (typické jsou abnormality jiných chromosomů než u VCA) ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn • chromosomové změny - strukturní často typické změny pro určité typy nádorů (jiné body zlomů než u VCA) – translokace – nejznámější translokace t(9;22) – Ph chromosom (Philadelphský chromosom) u chronické myeloidní leukemie - inverze - delece - amplifikace - v buňce je přítomno mnoho kopií genu (normální počet genů na 1 chromosomu je 1) (tato změna se nevyskytuje u VCA, je typická pro onkologická onemocnění) ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn VÝZNAM ONKOCYTOGENETICKÉHO VYŠETŘENÍ • zpřesnění diagnózy • stanovení prognózy onemocnění • zjištění fáze onemocnění (remise, relaps) • sledování úspěšnosti léčby (transplantace kostní dřeně při léčbě leukemií, chemoterapie) • charakteristika dosud nepopsaných chromosomových abnormalit TYPY NÁDORŮ VYŠETŘOVANÉ CYTOGENETICKY na OLG FN Brno • HEMATOLOGICKÉ MALIGNITY (leukemie) - lymfoblastická leukemie – postihuje buňky lymfoidní vývojové řady – akutní (ALL) – nejčastější u dětí - chronická (CLL) - myeloidní leukemie – postihuje buňky myeloidní vývojové řady – akutní (AML) - t(15;17), t(8;21), inv(16) - chronická (CML)- t(9;22) - Ph chromozom - myelodysplastický syndrom (MDS) – dysplastické změny v hemopoetických řadách v kostní dřeni – del(5) • SOLIDNÍ NÁDORY - všechny typy maligních nádorů u dětí – nádory CNS, Ewingův sarkom, Wilmsův tumor, osteosarkomy, lymfomy a další …… Doporučená literatura • Klinická genetika, Thompson 2001 • Základy klinickej genetiky, Sršeň, Sršňová 1995 • Základy lékařské genetiky, Pritchard, Korf 2003 Děkuji za pozornost