Co víme o kmenových buňkách? Kmenové buňky: Kriteria a definice Buňky, které mají dvě základní vlastnosti: Schopnost vytvořit identické kopie Schopnost vytvářet diferenciované/funkčně specializované buňky 1. Sebeobnova A B (PlurÍ)pOtenCe 2 Diferenciace Výzkum & biomedicínské aplikace Mechanismus sebeobnovy kmenových buněk (KB) Sebeobnova= tzv. self-renewal; nejdůležitější vlastnost kmenových buněk; schopnost vytvořit identické dceřiné buňk Asymetrické dělení Symetrické dělení Embryonální KB • •• <ŕ°m* í řt í í í / / í Buněčná smrt / Fetálnía dospělé KB (s výjimkami) ^"^ Biologický ústav Kombinace obou mechanismů = neuráiní kb iü Kapacita KB replikovat se in vivo a in vitro Replikační kapacita = počet zdvojení populace IN VIVO Embryonální KB Dospělé KB IN VITRO - Embryonální KB i Neurální KB Dospělé KB -v podmínách in vivo neexistujíIII -pravděpodobně po celý život (s výjimkami)) -neomezena -neomezená (?) -několik dělení Pro srovnání ^"^ Biologický ústav Somatické buňky Transformované (nádorové) buňky -??? nebo 0-50x -neomezená _______Diferenciační kapacita KB_______ totipotence ^ pluripotence ^ multipotence ^oligopotence ^unipotence zygota Embryonální KB Nediferencované KB ^Tm Bio1 Hematopoeticke KB Gastrointestinální KB KB prostaty Biologický ústav Příklady Linie KB - neomezený zdroj pluripotentních buněk ("Dostupnost" kmenových buněk pro manipulace in vitro) Embryonální KB ICM 7 dní v; ICM 10 dní = první pasáž Příklady dospělých KB Hematopoetické KB „niche" > mobilizace KB ' bunecne tndeni CD34+ CD133+ c-kit+ HLA-DR CD38 CD71- CD45- Schopnost růst a replikovat se in vitro Buněčná linie !!! Buněčná subpopulace !!! tf&sssz Budeme mít dostatek buněk pro terapeutické aplikace ? Dospělé KB a jejich „niche" ecná struktura a funkce „niche" Stem cell Progeny eel Hierarchie KB v jejich „niche" (epiteliální Gl KB) Niche cell Adhesive molecule ECM Basement membrane - r\ a c ^ rentJateň iDiifaisriliateif /LuiteififiliftleaV pfferetliated CiL ^J DilfE relating Ceis -Enteiüenüocrine -Guble: ■—L_ -Cnterocytc | U--^J 1~-~.Jy) \ / \ f TA = transient amplifying cells Basement Membra Hematopoeticé KB jsou v kostní dřeni Endothelium 1-7 = signály, které určují prostředí „niche" 8 = adhezní molekuly podporují přežívání KB Accessory cells Signály které definují „niche" Gl KB a regulují jejich proliferaci a diferenciaci - např. Wnt, BMP, Notch, Ihh {T> i Osteoblasts ■ Stimulatory V Stromal cells "Niche" je charakterizováno přítomností několika typů podpůrných buněk a mnoha signálními molekulami, které společně vytvářejí podmínky pro přežívání, případně diferenciaci KB Proč je znalost biologie kmenových buněk mimořádně důležitá pro současnou medicínu? ♦> možnost manipulace s KB v podmínkách in vitro, kombinovaná s možností řídit jejich diferenciaci a množení, je nezbytná pro vývoj nových tzv. buněčných terapií!!! ♦> pochopení mechanismů, které řídí diferenciaci a množení normálních KB představuje s velkou pravděpodobností klíč k pochopení vzniku mnoha nádorových onemocnění!!! orma PI uri potence Diferenciace o Buněčná smrt ^"^ Biologický ústav Akumulace abnormalit Patologie/nádory Q ® Q Historie objevů kmenových buněk (KB) Od Prometha k... > > > > > > .Omnis cellula e cellula" -Rudolf Virchow 1855 Primitivní KB v krvi -1917 „Kolonie-formující" buňky v kostní dřeni -1961 Embryonální karcinomové buňky -1974 Myší embryonální KB -1981 Dospělé KB -1980^ ^"^ Biologický ústav > > Embryonální KB z lidských blastocyst -1998 Indukované pluripotentní KB (tzv. iPS cells) - 2006 Kde můžeme nalézt počátky výzkumu embryonálních KB? Na začátku byly nádory (teratomy/teratokarcinomy) 1954 - kmen myší 129 -> přirozený vývoj testi kulárních terato karcinomů (Stevens & Little) Klíčový objev 1964- terato kare i n omy obsahují málo početnou populaci buněk, které mají kapacitu diferencovat do mnoha buněčných typů (Kleinsmith & Pierce) ---------PLURIPOTENTE--------- ^"^ Biologický úst Gail Martin Martin Evans Buňky získané z teratokarcinomů a udržované in vitro ukázaly další zajímavou vlastnost Kontinuální proliferace bez ztráty kapacity diferencovat - pluripotence 1974 - buňky z teratokarcinomů jsou pluripotentní i po dlouhodobém množení in vitro (Gail Martin & Martin Evans) -> SEBEOBNOVA (SELF-RENEWAL) Jiný důkaz pro pluripotenci 1974 - po injekci teratokarcinomových buněk do embrya ve stádiu blastocysty vznikají chiméry (Martin & Evans) j£ Biologický ústav iiUtťi fnliibn K<»ii>*!«wi ■ Linie pluripotentních kmenových buněk z myších embryí - embryonální kmenové buňky (Martin & Evans, 1981) Embryonální KB - krok od pluripotentních buněk s nádorovým charakterem (teratokarcinomových buněk) k normálním kmenovým buňkám ^"^ Biologický ústav Časné embryo ve stádiu blastocysty Aa Izolovaná vnitřní buněčná masa (epiblast) Izolovaný epiblast po přenesení do in vitro podmínek (+ podpůrné buňky + leukemický inhibiční faktor, LIF) Kultivace a pasážování buněk pomocí enzymatické disagregace kolonií (po neomezenou dobu) Nobelova cena za fyziologii a medicínu 2007 Vývoj technologií, které vedou k vytvoření tzv. knockout myší pomocí embryonálních KB, tj. možnost získání geneticky modifikovaných živých zvířat s požadovanými mutacemi ve všech buňkách A. Gene targeting of embryonic stem cells Pure popu lai ion of targeted ES cells B. Generation of gene targeted mice ^■^ Biologický ústav Gene large Led ticü ín'.k:. IA--I. Sir Martin Evans Pf W©v^®™| ' ■ 4. ^k i ■Lentivirový systém slouží k introdukci genetické informace (TF) do diferencovaných buněk >Transkripční faktory reprogramují diferencované buňky na „kmenovost" se všemi vlastnostmi GFP = Green Fluorescent Protein "SPS cells make germ line chimeras" Oct-4 GFP Oct-4 GFP Nanog GFP fibroblasty iPS buňky iPS buňky '•'■I -■•JeJ?:,-i Tzv. injekční chiméry (bílá a hnědá srst) Nanog GFP iPS chiméra Oct-4 GFP iPS chiméra ^Tm Bio1 \ ^ Lékařská Biologický ústav Použiti KB: "From bench to bedside" Téma pro výzkum •Mechanismus sebeobnovy KB •Mechanismus diferenciace a zastavení diferenciace - nádorové paradigma •Mechanismus dělení buněk a regulací buněčného cyklu •Vznik genomických abnormalit se vztahem k nádorům •Mechanismus časného vývoje člověka Budoucnost biomedicíny •Buněčná terapie •Modely nemocí •Vývoj léčiv •Testování toxicity ^"^ Biologický úst Současné pokroky v diferenciaci lidských embryonálních KB -biologické modely a aplikace ♦Neurony, astrocyty, oligodendrocyty ►Kardiomyocyty ►Insulin-produkující pankreatické buňky ►Krevní buňky ►Imunokompetentní buňky ►Endoteliální buňky ►Buňky trofoblastu ►Respiratory buňky ►Osteoblasty ►Hepatocyty ►Melanocyty ►Buňky prostaty ►Zárodečné buňky ^Tm Bio1 \ ^ Lékařská Biologický ústav Good Manufacturing Practices (GMP) a „clinical grade" buňky T"^ Biologický ústav £%ä. Definované "xeno-free" kultivační podmínky vývoj pro budoucí buněčné terapie Humanizované kultivační podmínky • Lidské substráty/fibroblasty (A, B) • Chemicky definované média (C) Hydrogely mohou sloužit jako nosiče nebo matrice pro kmenové buňky a jejich diferencované deriváty ^Tm Bio1 \ ^ Lékařská Biologický ústav Kultivace lidských embryonálních KB na korpuskulárních mikronosičích v suspenzi - možná cesta efektivní propagace? ° 16 * 1 12 -- <5 8 -Q I 4| *t ^--------£--------*--------í. g o 4 ----------1---------------------:-------------------■*"-------------------T-------------------*---------' 0 2 4 6 8 10 12 time [d] — monolayer culture ■*■ Cytodex3 -°- CultispherG -*- Cytopore "ra-1-60 £ 100^ (D 10° 10 102 103 10" Tra-1-81 10" 10 102 103 10" ^Tm Bio1 Biologický ústav Cellhost systém pro automatizovanou kultivaci lidských embryonálních KB w ^"^ Biologický ústav cytokeratin desmin im K i* H í« U 12 3 4 5 U i& »i n u n u 6 7 8 9 10 11 12 Aft M -1ft »I U II 13 14 15 16 19 20 21 22 Vývoj terapeutických protokolů s lidskými embryonálními KB Neurony získané diferenciací lidských embryonálních KB vytvářejí normální synaptické spoje. ^Tm Bio1 \ ^ Lékařská Příklad 1: Transplantace dopaminergních neuronů do krysích mozků (model Parkinsonovi nemoci) -integrace neuronů do poškozené tkáně -produkce dopaminu -znovuobnovení funkcí oogicýostav-vývoj nádorů (?)!!! Problematické je získání 100% populace neuronů pro terapeutické aplikace. Stejný problém existuje i v jiných případech cílených diferenciací. Vývoj terapeutických protokolu s lidskými embryonálními KB Příklad 2: Transplantace pankreatických a endokrinních progenitorů u myších modelů -integrace progenitorů do tkáně -přeměna na sekreční Deta buňky -syntéza pro-inzulinu a C peptidu -nutnost současné transplantace „instruktivních" buněk !!! ^"^ Biologický ústav Vývoj terapeutických protokolů s lidskými embryonálními KB Příklad 3: Dlouhodobá hematopoetická repopulace u ozářených myší a ovcí :vU^-— 1 ' ^^^^^^^J * ^ lák«. Biologický ústav -nízká účinnost diferenciace in vitro -CD34+ a CD45+ buňky osídlují kostní dřeň -CD34+ a CD45+ buňky dlouhodobě přežívají a množí se v kostní dřeni -jednou transplantované hematopoetické buňky mohou být opakovaně transplantovány -hlavní bariéru tvoří NK buňky příjemce !!! Vývoj terapeutických protokolů s lidskými embryonálními KB \yů._ m BT1 * f1^ '■SB Kl jt Tf^* Příklad 4: Transplantace kardiomyocytu do krysího srdce s infarktem myokardu -"tepající" kardiomyocyty mohou být derivovány z lidských embryonálních kmenových buněk ve velkých množstvích -buňky se dobře zabudovávají do ischemické tkáně a obnovují kontrakce srdečního svalu -buňky reagují na vnější stimuly stejně jako původní "zdravé" buňky -problém vazivové, tzv. ischemické jizvy? Definice I. • Embryonální KB jsou buňky embryonálního původu se schopností sebeobnovy, multiliniové diferenciace in vitro a in vivo, klonogenní kapacitou, normálním karyotypem, dostatečnou proliferační kapacitou in vitro v definovaných podmínkách a schopností hlubokého zamrazení a rozmrazení bez výrazné ztráty životaschopnosti. Kombinace těchto vlastností je nazývaná "kmenovostí" (sternness). Biologický ústav Definice II. • Dospělé KP jsou buňky s klonálním potenciálem, které jsou za fyziologických podmínek přítomné v různých orgánech a tkáních, sebeobnovuji se, a průběžně, nebo když dostanou vnější signál, začínají diferencovat a vytvářejí funkčně specializované buňky potřebné k regeneraci orgánů a tkání. Biologický ústav Definice III. • Indukované pluripotentní buňky (tzv. induced pluripotent stem cells; iPS cells) jsou buňky vytvořené z dospělých diferencovaných buněk (tj. somatických buněk) pomocí „jednoduché" metody - geny kDodující několik (2-4) transkripčních faktorů jsou klonovány do virového vektoru a jednoduchým přidáním takových vektorů do in vitro kultury somatických buněk (např. fibroblastů) dojde za určitých podmínek k „reprogramaci" buněk do pluripotentního embryonálního stavu. Biologický ústav Co víme o kmenových buňkách?