Hlavní mechanismy rezistence. In vitro testování citlivosti a rezistence. Základy antimikrobiální terapie – VSAT081 Týden 4 Ondřej Zahradníček Rezistence mikrobů na antimikrobiální látky • Primární rezistence: všechny kmeny daného druhu jsou rezistentní. Příklad: betalaktamová atb nepůsobí na mykoplasmata, která vůbec nemají buněčnou stěnu. • Sekundární rezistence: vznikají necitlivé mutanty, a ty při selekčním tlaku antibiotika začnou převažovat. (Escherichie mohou být citlivé na ampicilin, ale v poslední době výrazně přibývá rezistentních kmenů Mechanismy rezistence I • Mikrob zabrání vniknutí antibiotika do buňky • Mikrob aktivně vypuzuje atb z buňky • Mikrob změní cílový receptor nebo nabídne antibiotiku falešný receptor • Mikrob prodělá metabolické změny, jež atb zabrání vyvinout účinek v obvyklých cílových strukturách • Mikrob enzymaticky štěpí antibiotikum (například betalaktamázy štěpí betalaktamová antibiotika) Mechanismy rezistence II: vzájemné rozdíly mezi nimi • Některé rezistence jsou kódovány chromozomálně • Jiné naopak plasmidově, přičemž plasmidy mohou být předávány vnitro- i mezidruhově Mechanismy rezistence: I. Betalaktamová antibiotika • Změna penicilin-vázajících proteinů (penicilin binding proteins, PBP), např. u MRSA (podrobněji příště) • Snížená permeabilita membrány • Produkce betalaktamáz, například: – Stafylokokové penicilinázy – Penicilinázy enterobakterií – Cefalosporinázy různých mikrobů – Širokospektré betalaktamázy (podrobněji příště) Betalaktamázy • Existuje jich různé typy, mohou být účinné proti všem či většině betalaktamových atb či jen proti některým z nich • Mohou být kódovány chromozomálně i plasmidově • Principem je vždy rozštěpení betalaktamového kruhu Penicilináza – první betalaktamáza Oxacilin – ochrana proti stafylokokové penicilináze Klasifikace betalaktamáz dle Bushe Alterace PBP (penicilin binding proteins) Mechanismy rezistence: II. Aminoglykosidy a makrolidy • Snížená vazba na cílové ribozomy • Snížená permeabilita buněčné stěny • Produkce inaktivujících enzymů Jak streptomycin (či jiný aminoglykosid) přestane být účinný Mechanismy rezistence: IV. Tetracykliny • Nedostupnost cílových ribozomů • Aktivní buněčný eflux (vylučování atb z buňky) Eflux Silnější chinolon (ciprofloxacin) je ještě účinný, slabší už ne. Ale i při použití toho silnějšího je nutná opatrnost! Mechanismy rezistence: VI. Sulfonamidy, trimetoprim • Rezistence syntetázy kyseliny dihydrolistové • Rezistence reduktázy kyseliny dihydrolistové • Snížená permeabilita Resistence – shrnutí • Jak jsme viděli, je celá řada mechanismů rezistence, a celá řada možností genetického kódování • Tudíž nelze ke všem rezistencím přistupovat stejně: – Některé jsou epidemiologicky významné, jiné ne. – Některé se týkají jen jednoho antibiotika, jiné celé skupiny či několika skupin – Některé lze překonat zvýšeným dávkováním antibiotika (jde spíše o kvantitativní posun, „horší účinnost“ – časté např. u aminoglykosidů) – U jiných jde o rezistenci „buď anebo“. Pokud je, nelze ji překonat ani mnohonásobkem normální dávky Přenos genů pro rezistenci různými způsoby Selekce rezistentních kmenů Další důvod in vitro neúčinnosti: Bakterie v biofilmu Následujících několik obrazovek je převzato, přeloženo a upraveno z prezentace mé kolegyně: Stádia rozvoje biofilmu • Přímý kontakt planktonických bakterií s povrchem + • Přilnutí na tento povrch • Adhese, růst a shlukování bakterií do mikrokolonií • Produkce polymerické matrix • Vytvoření třidimenzionální struktury známé jako biofilm Hlavní význam tvorby biofilmu Neúčinnost antibiotik může být způsobena • Polyanionickým nábojem usazených buněk • Sníženým množením bakterií • Difusní bariérou glykokalyxu • Reakcí s matrix biofilmu • Tvorbou chráněných fenotypů • Mechanismy intercelulární signalizace (quorum sensing) • Vlivem imunitní odpovědi hostitele Příklad: citlivost kmene Staphylococcus aureus číslo 351 Řešení • Myslet na reálnou skutečnost, že bakterie nežijí jen v planktonické formě, ale i ve formě biofilmu (zejména u některých typů infekcí) • Využívat synergických kombinací antibiotik • Vedle MIC vyšetřovat i MBIC/MBEC, a to nejen na jednotlivá atb, ale i na kombinace • Využívat jinou než atb terapii (výměna katetru, lokální léčba a podobně) Tato problematika je v současnosti předmětem výzkumných úkolů. Realitou je i to, že in vivo může být terapie úspěšná i tam, kde podle in vitro stanovení MBIC by být neměla Povědomí o rezistenci na antibiotika je nutno šířit i mezi sestrami Metody zjišťování citlivosti in vitro • Zjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři • Nezaručí stoprocentní účinnost léčby • Přesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií Difúzní diskový test • Na MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie • Pak se nanášejí tzv. antibiotické disky – papírky napuštěné antibiotikem • Atb difunduje (prostupuje) z disku agarem dál • Koncentrace atb klesá se vzdáleností od disku • Pokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý) • Je-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý. Difúzní diskový test E-testy • Podobné v principu difúznímu diskovému testu • Místo disku se však použije proužek • V proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (získáno díky speciální technologii – proto jsou tak drahé) • Zóna není kruhová, ale vejčitá. • Test je kvantitativní • Na papírku je stupnice – jednoduché odečítání (viz obrázek na další obrazovce) E-test: ukázka Mikrodiluční test • Atb je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá • Nejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC • V přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen cilivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní • Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu) Mikrodiluční test – ukázka Interpretace stanovení MIC • Klinický mikrobiolog by si měl všímat nejen citlivosti či rezistence, ale i např. vzestupu MIC, který stále ještě zůstává v pásmu citlivosti • V rámci konzultace pracovníka antibiotického střediska je možné, že pracovník navrhne i použití antibiotika, kde výsledek vyjde jako „rezistentní“, rezistence je však překonatelná zvýšeným dávkováním • To je však možné jen u některých antibiotik, u jiných by byl takový postup nesprávný Příklady interpretace MIC (1) Příklady interpretace MIC (2) Kdy nestačí „citlivost“ • U močových infekcí by nás měl zajímat breakpoint odvozený od koncentrací dosažitelných v moči, nikoli v séru. (U většiny močových infekcí se ovšem MIC nezjišťuje) • U abscesů, procesů v kostech a zejména u meningitid: breakpointy jsou vyjádřením koncentrace atb především v séru, a že v různých místech těla mohou být mnohem nižší • Je také nutno počítat s tím, že mikroby mohou existovat ve formě biofilmu – nutno určovat hodnoty např. minimální biofilm eradikující konc. MIC versus MBIC a MBEC • Zatímco MIC je metoda určující minimální inhibiční koncentraci ATB u planktonické formy, MBIC zjistí inhibici a MBEC eradikaci bakteriálního biofilmu. Vypovídá tedy lépe o skutečném účinku antibiotika na bakterie žijící ve formě biofilmu. • MBEC odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu Určování MBIC a MBEC Jak se odečítá MBEC I Destičky A a B se přiloží k sobě a odečítají společně. Dvě destičky jsou nutné proto, že hodnoty v základní destičce, na rozdíl od testování MIC, zpravidla nestačí, takže je destičku nutno „nastavit“ Lze si celou dvojici destiček představit jako jednu destičku, kde je každé antibiotikum v šestnácti různých koncentracích Jak se odečítá MBEC II Zelené kroužky označují důlky s hodnotami MBEC pro atb ve druhém až pátém sloupci. Pro antibiotikum v prvním sloupci nelze hodnotu MBEC určit, je příliš vysoká (vyšší než sledované) Zjišťování faktorů rezistence • Někdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz. • Může se jednat o diagnostické proužky (chemický průkaz daného enzymu) nebo testy na jiném principu. • Používá se zejména tam, kde testy citlivosti nedávají spolehlivé výsledky (z různých důvodů, např. nepůsobí testovaná látka přímo, ale jeho metabolit, a podobně) Testování kmenů na produkci běžných betalaktamáz Testování na produkci širokospektrých betalaktamáz Genotypové metody • V poslední době se čím dál více prosazuje také detekce genů zodpovědných za rezistenci • Nutno si ale uvědomit, že přítomnost genu ještě neznamená jeho expresi. Ta může být dána jak přítomností dalších genů, tak i řadou jiných faktorů • Fenotypové metody jsou tedy nezastupitelné Děkuji za pozornost