Krevní barviva – porfyriny, hemoglobin, bilirubin Porfyriny: Poruchy metabolismu porfyrinů: l Získané (např. při otravě olovem) l S dědičným podkladem – porfyrie Porfyriny - tetrapyroly, prekurzory hemu - Vznikají řadou na sebe navazujících reakcí - První je tvorba kyseliny 5 - aminolevulové (ALA) z glycinu a sukcinátu katalyzovaná syntázou kyseliny 5 – aminolevulové - popsáno osm variat - Druhým enzymem – porfobilinogensyntáza -vznik porfobilinogenu z 2 molekul ALA Porfyrie - defekt tvorby kteréhokoliv enzymu syntézy porfyritů za stupněm ALA - vysoká koncentrace ALA typická Porfyrie: l charakterizovány hromaděním porfyrinů nebo jejich prekurzorů v některých tkáních l zvýšenou hladinou v plasmě či v erytrocytech l zvýšeným vylučováním porfyrinů nebo jejich prekurzorů stolicí nebo močí Klinické příznaky: l Fotosenzitivita – absorpce světla v oblasti 400 nm, volné radikály poškodí kožní buňky l Akutní bolest v břiše a neurologické příznaky Porfyrie - koncentrace porfyrinů zvýšena - v erytrocytech - v játrech Symptomatická jaterní porfyrie ( Porfyria cutanea tarda) l nejčastější, patří mezi jaterní porfyrie (poškození jater) l při nedostatku uroporfirogen dekarboxylasy. Objevuje se v pozdějším věku. Akutní intermitentní porfyrie – porucha přeměny porfobilinogenu a porucha metabolismu steroidů v játrech (hromadí se a indukují tvorbu syntázy ALA) Celá řada dalších typů porfyrií Rozlišení typů - analýza porfyrinů nejčastěji v moči - zřídka v plasmě, erytrocytech a stolici - analýza enzymů - výjimečně, v ČR se provádí ve VFN Praha (dehydratáza 5-aminolevulátu) Stanovení porfyrinů a jejich prekursorů l screeningový test s Ehrlichovým činidlem na PBG a ALA Kvantitativní stanovení Stanovení porfobilinogenu (PBG) v moči: l Reakce porfobilinogenu v kyselém prostředí s p-dimetylaminobenzaldehydem (Ehrlichovo činidlo) l Vznik červeného kondenzačního produktu l Reakce není specifická l Rozlišovací test na odlišení PBG od urobilinogenu – extrakci do chloroformu v prostředí octanu sodného l Červené zbarvení pouze ve vodné fázi PBG l Referenční rozmezí: do 36 umol/l Stanovení 5-aminolevulátu v moči: l 5-aminolevulát se reakcí s acetylacetonem a formaldehydem převede na fluorescenční derivát l Stanovení HPLC metodou s fluorescenčním detektorem l Referenční rozmezí: do 20 umol/l Stanovení celkových porfyrinů: l V okyselené moči (kys. sírová) l Spektrofotometrická křivka v oblasti 350-450 nm – max. 400 nm l Při větším podílu uroporfyrinu 405 nm l Materiál nutno chránit před světlem l Fyziologické rozmezí je do 144 ug/l Stanovení jednotlivých porfyrinů: l V okyselené moči metodou HPLC na reverzní fázi s použitím fluorescenčního detektoru (fosf. pufr, metanol) l Materiál – sbíraná moč za 24 hod konzervovaná Na[2]CO[3] Nutno chránit před světlem l Referenční rozmezí Uroporfyrin : do 0,050 µmol / 24 hod Koproporfyrin : do 0,280 µmol / 24 hod Heptaporfyrin : do 0,014 µmol / 24 hod Hexaporfyrin : do 0,006 µmol / 24 hod Pentaporfyrin : do 0,005 µmol / 24 hod Obr.2: Chromatogram s píky jednotlivých porfyrinů Hemoglobin l Červeně zbarvená bílkovina obsažená v erytrocytech l Patří mezi konjugované bílkoviny - spojením bílkoviny s organickým komplexem obsahujícím kov l Hemoglobin tvořen z hemu (protoporfyrin IX s navázaným Fe^2^+ ) a bílkoviny globin l Globin je tvořen 2 polypeptidickými řetězci a a dvěma řetězci b l Molekula ve tvaru čtyřstěnu l Každý globinový řetězec je v jednom rohu, porfyrinové řetězce jsou umístěny v dutinách řetězců s atomem Fe uprostřed l Molekula sestává ze čtyř hemů, obsahuje 4 atomy Fe l U dospělých - hemoglobin tvořen z 96% HbA (a 2 b 2) l Z 2-3% HbA2 (obsahuje d řetězce a značí se a 2 d 2 ) l Fetální hemoglobin (HbF) dominuje ve fetálním životě - Během prvního roku života dítěte ubývá - U dospělých asi 1%. - Skládá se ze dvou a a dvou g řetězců Deriváty hemoglobinu: V hemoglobinu železo ve formě Fe^2+, v oxidované i neoxidované formě oxygenovaný hemoglobin se nazývá oxyhemoglobin l Methemoglobin – vzniká z hemoglobinu oxidací železa na Fe^3+ - Nemůže vázat kyslík - Běžně konc. pod 1,5% - Kongenitální methemoglobinémie - údržba Fe^2+ narušena nedostatkem NADH methemoglobin reduktázy - Metabolická acidóza nebo kóma - zvýšení konc. methemoglobinu - Hladiny nad 70% mohou být letální l Karboxyhemoglobin – vniká při otravách s oxidem uhelnatým l Sulfhemoglobin – degradační produkt hemoglobinu v silně kyselém prostředí l Karbonylhemoglobin – fyziologický komplex s oxidem uhličitým Talasémie, Hemoglobinopatie Hemoglobinopatie: l Strukturální abnormality jednoho či druhého globinového řetězce ( záměna aminokyseliny v řetězci). l Více než 700 typů - většina se klinicky nemanifestuje l Více než 100 druhů anemií má nestabilní a či b globinové řetězce – nestabilní hemoglobinová hemolytická anémie l Srpkovitá anémie - u homozygotů defekt tvaru erytrocytů, anémie, bolest kloubů, infarkt různých orgánů - S forma hemoglobinu ( záměna kys. glutamové za valin) Talasémie: l Dědičné poruchy - změna poměru syntézy jednoho či druhého globinového řetězce l a -talasémie (Afrika, jihovýchodní Asie) – redukce a řetězců l b -talasémie (Středomoří, Indie, jižní Čína) – redukce b řetězců l Množství variant, kombinace talasémií l Někdy bez klinických příznaků, jindy s výraznou anémií Stanovení hemoglobinu: l Nejčastěji v plné krvi l Stopy v séru, plasmě, moči a stolici - na základě pseudoperoxidázové aktivity - hem obsahující Fe^2+ katalyzuje oxidaci některých barviv benzidinového typu peroxidem vodíku Stanovení Hb v plné krvi s hexakyanoželezitanem (Drabkin) – referenční metoda: l Hb se lyzačním roztokem (hypotonický pufr) uvolní z erytrocytů l Hb + Fe (CN) [6]^3- ® MetHb + Fe (CN)[6]^4- l Met Hb + CN- ® MetHbCN l Vznik kyanidového komplexu, měří se fotometricky při 540 nm Stanovení Hb v plné krvi: l Hemoglobin se stanovuje přímou fotometrií l Na hematologických automatech po zlyzování erytrocytů jako součást stanovení krevního obrazu l V biochemii jako součást ABR analyzátorů - měření absorpce světla v plné krvi (využití rozptylu světla červenými krvinkami - světelným zdrojem je laser Stanovení derivátů hemoglobinu: l Provádí se na oximetrech -samostatné přístroje - oximetrický modul součást přístrojů na ABR l Deriváty hemoglobinu - měří se spektrofotometricky na základě Lambert-Beerova zákona l Stanovuje se celkový hemoglobin, oxyhemoglobin, karbonylhemoglobin, methemoglobin a sulfhemoglobin l K methemoglobinu i sulfhemoglobinu jsou rovněž popsány fotometrické metody Referenční interval hemoglobinu v plné krvi: l M 130-175 g/l l Ź 120-165 g/l Stanovení hemoglobinu Stanovení glykovaného hemoglobinu: l Stanovení frakce HBA 1c zvýšené u diabetiků l Metodou HPLC na spec. přístrojích Stanovení hemoglobinu ve stolici: l Screening na OK – viz. screeningová stanovení Stanovení hemoglobinu v moči: l Součást chemické analýzy moče s diagnostickými proužky Stanovení volného hemoglobinu v plasmě nebo séru: l Metoda pro zjištění intravaskulární hemolýzy l Hranice - nad 300 mg Hb/l patologická l Šetrný odběr - nádobka s heparinátem litným, stáčet při 2000ot/min Ruční metoda: l Absorpční spektrum při 340 – 600 nm, derivuje se max. 403 – 405 nm Metoda na automatickém analyzátoru: l semikvantitativní stanovení l využívá měření sérových indexů (hemoglobin, lipidy, bilirubin). l proměřuje se absorbance při šesti vlnových délkách (480, 505, 570, 600, 660 a 700 nm) Identifikace hemoglobinových variant l Dříve se používala elektroforéza l Dnes dominují molekulární techniky, imunometody, HPLC, kapilární elektroforéza a MS Bilirubin l Doporučená rutinní metoda: Jendrassik – Gróf, fotometrické metody s DCA a DPD l Referenční metoda: Doumas – Perry Bilirubin l Lineární tetrapyrolové barvivo l Vzniká z uvolněného hemoglobinu při rozpadu erytrocytů l Není jednotná látka - řada tetrapyrolů l Erytrocyty zanikají a hemoglobin metabolizuje ve slezině l Vznik biliverdinu, ten redukován na bilirubin l Bilirubin vázaný na albumin transportován do jater l V játrech extrahován hepatocyty a navázán na kyselinu glukuronovou– stává se ve vodě rozpustným l Konjugovaný bilirubin vylučován žlučovými cestami do tenkého střeva. l Tam redukce na další barevné produkty (urobilinogen, sterkobilinogen) l Část vstřebána zpět do jater - část vylučována močí a stolicí Obr.3: Konverze hemu na biliverdin a redukce biliverdinu na bilirubin Bilirubin- přímý a nepřímý l Přímý - dává po přidání směsi diazočinidel k séru přímo zbarvení l Přímý odpovídá bilirubinu konjugovanému - podíl, který již prošel játry, kde byl konjugován l Bilirubin nepřímý – nerozpustný ve vodě, vázaný na albumin, dosud játry neprošel l Nekonjugovaný je třeba uvolnit z vazby na albumin (kofeinu, benzoátu sodného) l Sérum nutno chránit před přímým světlem – pokles Stanovení bilirubinu - historie: l a) bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - Ehrlichv r. 1883 - současné metody z reakce vychází l b) Tradiční metoda - papírová a tenkovrstvá chromatografie. Čtyři frakce – nekonjugovaný, mono a dikonjugovaný a vázaný na protein Stanovení bilirubinu celkového a přímého s diazotovanou kyselinou sulfanilovou: Metoda Jendrassik – Gróf ( r. 1938): l Celkový bilirubin - po přídavku akcelerátoru - kofein + benzoát (Při stanovení bilirubinu konjugovaného se tento krok vynechá) l Přidat diazotovanou kyselinu sulfanilovou (činidlo z dusitanu sodného a kyseliny sulfanilové) l Vznik červeně zbarveného azobilirubinu s abs. max. 440 nm (interferuje hemolýza) l Modrá forma azobilirubinu – po 10 minutách k reakci přidat NaOH a vínan sodno-draselný - 600 nm, hemolýza nevadí l Při stanovení přímého bilirubinu reakci zastavit kyselinou askorbovou Obr. 4: Kopulace bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - tvorba azobilirubinu Stanovení bilirubinu Metoda Doumase - Perry (r. 1985): l Vychází z metody Jendrassik – Gróf, všechny kroky optimalizovány a specifikovány Stanovení bilirubinu celkového s DPD: l Jako akcelerátor používá detergent (nedochází k precipitaci proteinů), silně kyselé prostředí l Rychlá reakce dichlorofenyldiazonium tetrafluoroborátu (DPD) s bilirubinem - tvorba azobilirubinu l Hemolýza interferuje u dospělých Stanovení bilirubinu Stanovení bilirubinu celkového s derivátem kyseliny sulfámové: l Nový typ diazoniové soli l Reagencie se používají přímo, v analyzátoru velmi stabilní l Potlačena interference hemolýzy Enzymové stanovení bilirubinu přes biliverdin: l Oxidace bilirubinu kyslíkem na zelený biliverdin – s bilirubinoxidasou l Měří se pokles absorbance – 424 - 465 nm Stanovení bilirubinu přímou spektrofotometrií u novorozenců: l Absorbance se měří při 454 nm l Metoda nelze použít u starších dětí nebo dospělých - výsledky by mohla ovlivňovat přítomnost karotenu a jiných pigmentů