Krevní barviva – porfyriny, hemoglobin, bilirubin sejmout0002 Porfyriny: lPoruchy metabolismu porfyrinů: lZískané (např. při otravě olovem) lS dědičným podkladem – porfyrie l lPorfyriny - tetrapyroly, prekurzory hemu l- Vznikají řadou na sebe navazujících reakcí l- První je tvorba kyseliny 5 - aminolevulové (ALA) z glycinu a sukcinátu katalyzovaná syntázou kyseliny 5 – aminolevulové - popsáno osm variat l- Druhým enzymem – porfobilinogensyntáza -vznik porfobilinogenu z 2 molekul ALA lPorfyrie - defekt tvorby kteréhokoliv enzymu syntézy porfyritů za stupněm ALA l - vysoká koncentrace ALA typická Porfyrie: lcharakterizovány hromaděním porfyrinů nebo jejich prekurzorů v některých tkáních lzvýšenou hladinou v plasmě či v erytrocytech l zvýšeným vylučováním porfyrinů nebo jejich prekurzorů stolicí nebo močí lKlinické příznaky: lFotosenzitivita – absorpce světla v oblasti 400 nm, volné radikály poškodí kožní buňky lAkutní bolest v břiše a neurologické příznaky Porfyrie - koncentrace porfyrinů zvýšena - v erytrocytech - v játrech lSymptomatická jaterní porfyrie ( Porfyria cutanea tarda) lnejčastější, patří mezi jaterní porfyrie (poškození jater) lpři nedostatku uroporfirogen dekarboxylasy. Objevuje se v pozdějším věku. lAkutní intermitentní porfyrie – porucha přeměny porfobilinogenu a porucha metabolismu steroidů v játrech (hromadí se a indukují tvorbu syntázy ALA) lCelá řada dalších typů porfyrií lRozlišení typů - analýza porfyrinů nejčastěji v moči l - zřídka v plasmě, erytrocytech a stolici l - analýza enzymů - výjimečně, v ČR se provádí ve l VFN Praha (dehydratáza 5-aminolevulátu) Stanovení porfyrinů a jejich prekursorů lscreeningový test s Ehrlichovým činidlem na PBG a ALA lKvantitativní stanovení l lStanovení porfobilinogenu (PBG) v moči: lReakce porfobilinogenu v kyselém prostředí s l p-dimetylaminobenzaldehydem (Ehrlichovo činidlo) lVznik červeného kondenzačního produktu lReakce není specifická lRozlišovací test na odlišení PBG od urobilinogenu – extrakci do chloroformu v prostředí octanu sodného lČervené zbarvení pouze ve vodné fázi PBG lReferenční rozmezí: do 36 umol/l lStanovení 5-aminolevulátu v moči: l5-aminolevulát se reakcí s acetylacetonem a formaldehydem převede na fluorescenční derivát lStanovení HPLC metodou s fluorescenčním detektorem lReferenční rozmezí: do 20 umol/l lStanovení celkových porfyrinů: lV okyselené moči (kys. sírová) lSpektrofotometrická křivka v oblasti 350-450 nm – max. 400 nm lPři větším podílu uroporfyrinu 405 nm lMateriál nutno chránit před světlem lFyziologické rozmezí je do 144 ug/l l lStanovení jednotlivých porfyrinů: lV okyselené moči metodou HPLC na reverzní fázi s použitím fluorescenčního detektoru (fosf. pufr, metanol) lMateriál – sbíraná moč za 24 hod konzervovaná Na2CO3 l Nutno chránit před světlem l Referenční rozmezí l Uroporfyrin : do 0,050 µmol / 24 hod l Koproporfyrin : do 0,280 µmol / 24 hod l Heptaporfyrin : do 0,014 µmol / 24 hod l Hexaporfyrin : do 0,006 µmol / 24 hod l Pentaporfyrin : do 0,005 µmol / 24 hod l Obr.2: Chromatogram s píky jednotlivých porfyrinů ob1 Hemoglobin lČerveně zbarvená bílkovina obsažená v erytrocytech lPatří mezi konjugované bílkoviny - spojením bílkoviny s organickým komplexem obsahujícím kov lHemoglobin tvořen z hemu (protoporfyrin IX s navázaným Fe2+ ) a bílkoviny globin lGlobin je tvořen 2 polypeptidickými řetězci a a dvěma řetězci b lMolekula ve tvaru čtyřstěnu lKaždý globinový řetězec je v jednom rohu, porfyrinové řetězce jsou umístěny v dutinách řetězců s atomem Fe uprostřed lMolekula sestává ze čtyř hemů, obsahuje 4 atomy Fe lU dospělých - hemoglobin tvořen z 96% HbA (a 2 b 2) lZ 2-3% HbA2 (obsahuje d řetězce a značí se a 2 d 2 ) lFetální hemoglobin (HbF) dominuje ve fetálním životě l - Během prvního roku života dítěte ubývá l - U dospělých asi 1%. l - Skládá se ze dvou a a dvou g řetězců Deriváty hemoglobinu: lV hemoglobinu železo ve formě Fe2+, v oxidované i neoxidované formě loxygenovaný hemoglobin se nazývá oxyhemoglobin lMethemoglobin – vzniká z hemoglobinu oxidací železa na Fe3+ l - Nemůže vázat kyslík l - Běžně konc. pod 1,5% l - Kongenitální methemoglobinémie - údržba Fe2+ narušena l nedostatkem NADH methemoglobin reduktázy l - Metabolická acidóza nebo kóma - zvýšení konc. methemoglobinu l - Hladiny nad 70% mohou být letální lKarboxyhemoglobin (Karbonylhemoglobin)– vniká při otravách s oxidem uhelnatým lSulfhemoglobin – degradační produkt hemoglobinu v silně kyselém prostředí lKarbaminohemoglobin (Hb-NHCOOH, karbohemoglobin) – sloučenina hemoglobinu a oxidu uhličitého, který je v této formě transportován krví Talasémie, Hemoglobinopatie lHemoglobinopatie: lStrukturální abnormality jednoho či druhého globinového řetězce ( záměna aminokyseliny v řetězci). lVíce než 700 typů - většina se klinicky nemanifestuje lVíce než 100 druhů anemií má nestabilní a či b globinové řetězce – nestabilní hemoglobinová hemolytická anémie lSrpkovitá anémie - u homozygotů defekt tvaru erytrocytů, anémie, bolest kloubů, infarkt různých orgánů - S forma hemoglobinu ( záměna kys. glutamové za valin) l lTalasémie: lDědičné poruchy - změna poměru syntézy jednoho či druhého globinového řetězce la -talasémie (Afrika, jihovýchodní Asie) – redukce a řetězců lb -talasémie (Středomoří, Indie, jižní Čína) – redukce b řetězců lMnožství variant, kombinace talasémií lNěkdy bez klinických příznaků, jindy s výraznou anémií l Stanovení hemoglobinu: lNejčastěji v plné krvi lStopy v séru, plasmě, moči a stolici - na základě pseudoperoxidázové aktivity - hem obsahující Fe2+ katalyzuje oxidaci některých barviv benzidinového typu peroxidem vodíku l lStanovení Hb v plné krvi s hexakyanoželezitanem (Drabkin) – lreferenční metoda: lHb se lyzačním roztokem (hypotonický pufr) uvolní z erytrocytů lHb + Fe (CN) 63- ® MetHb + Fe (CN)64- lMet Hb + CN- ® MetHbCN lVznik kyanidového komplexu, měří se fotometricky při 540 nm l Stanovení Hb v plné krvi: lHemoglobin se stanovuje přímou fotometrií lNa hematologických automatech po zlyzování erytrocytů jako součást stanovení krevního obrazu lV biochemii jako součást ABR analyzátorů - měření absorpce světla v plné krvi (využití rozptylu světla červenými krvinkami - světelným zdrojem je laser l lStanovení derivátů hemoglobinu: lProvádí se na oximetrech -samostatné přístroje l - oximetrický modul součást přístrojů na ABR lDeriváty hemoglobinu - měří se spektrofotometricky na základě Lambert-Beerova zákona lStanovuje se celkový hemoglobin, oxyhemoglobin, karbonylhemoglobin, methemoglobin a sulfhemoglobin lK methemoglobinu i sulfhemoglobinu jsou rovněž popsány fotometrické metody l Referenční interval hemoglobinu v plné krvi: l l lM 130-175 g/l lŹ 120-165 g/l l Stanovení hemoglobinu lStanovení glykovaného hemoglobinu: lStanovení frakce HBA 1c zvýšené u diabetiků lMetodou HPLC na spec. přístrojích l lStanovení hemoglobinu ve stolici: lScreening na OK – viz. screeningová stanovení l lStanovení hemoglobinu v moči: lSoučást chemické analýzy moče s diagnostickými proužky Stanovení volného hemoglobinu v plasmě nebo séru: lMetoda pro zjištění intravaskulární hemolýzy lHranice - nad 300 mg Hb/l patologická lŠetrný odběr - nádobka s heparinátem litným, stáčet při 2000ot/min l lRuční metoda: lAbsorpční spektrum při 340 – 600 nm, derivuje se l max. 403 – 405 nm l lMetoda na automatickém analyzátoru: lsemikvantitativní stanovení lvyužívá měření sérových indexů (hemoglobin, lipidy, bilirubin). lproměřuje se absorbance při šesti vlnových délkách (480, 505, 570, 600, 660 a 700 nm) Identifikace hemoglobinových variant l lDříve se používala elektroforéza lDnes dominují molekulární techniky, imunometody, HPLC, kapilární elektroforéza a MS Bilirubin lDoporučená rutinní metoda: Jendrassik – Gróf, fotometrické metody s DCA a DPD l lReferenční metoda: Doumas – Perry Bilirubin lLineární tetrapyrolové barvivo lVzniká z uvolněného hemoglobinu při rozpadu erytrocytů lNení jednotná látka - řada tetrapyrolů lErytrocyty zanikají a hemoglobin metabolizuje ve slezině lVznik biliverdinu, ten redukován na bilirubin lBilirubin vázaný na albumin transportován do jater lV játrech extrahován hepatocyty a navázán na kyselinu glukuronovou– stává se ve vodě rozpustným lKonjugovaný bilirubin vylučován žlučovými cestami do tenkého střeva. lTam redukce na další barevné produkty (urobilinogen, sterkobilinogen) lČást vstřebána zpět do jater - část vylučována močí a stolicí Obr.3: Konverze hemu na biliverdin a redukce biliverdinu na bilirubin 1 Bilirubin- přímý a nepřímý lPřímý - dává po přidání směsi diazočinidel k séru přímo zbarvení lPřímý odpovídá bilirubinu konjugovanému - podíl, který již prošel játry, kde byl konjugován lBilirubin nepřímý – nerozpustný ve vodě, vázaný na albumin, dosud játry neprošel lNekonjugovaný je třeba uvolnit z vazby na albumin (kofeinu, benzoátu sodného) lSérum nutno chránit před přímým světlem – pokles Stanovení bilirubinu - historie: la) bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - Ehrlichv r. 1883 - současné metody z reakce vychází l lb) Tradiční metoda - papírová a tenkovrstvá chromatografie. l Čtyři frakce – nekonjugovaný, mono a dikonjugovaný a vázaný na protein Stanovení bilirubinu celkového a přímého s diazotovanou kyselinou sulfanilovou: lMetoda Jendrassik – Gróf ( r. 1938): lCelkový bilirubin - po přídavku akcelerátoru - kofein + benzoát (Při stanovení bilirubinu konjugovaného se tento krok vynechá) lPřidat diazotovanou kyselinu sulfanilovou (činidlo z dusitanu sodného a kyseliny sulfanilové) lVznik červeně zbarveného azobilirubinu s abs. max. 440 nm (interferuje hemolýza) lModrá forma azobilirubinu – po 10 minutách k reakci přidat NaOH a vínan sodno-draselný - 600 nm, hemolýza nevadí lPři stanovení přímého bilirubinu reakci zastavit kyselinou askorbovou Obr. 4: Kopulace bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - tvorba azobilirubinu 3 Stanovení bilirubinu lMetoda Doumase - Perry (r. 1985): lVychází z metody Jendrassik – Gróf, l všechny kroky optimalizovány a specifikovány l lStanovení bilirubinu celkového s DPD: lJako akcelerátor používá detergent (nedochází k precipitaci proteinů), silně kyselé prostředí lRychlá reakce dichlorofenyldiazonium tetrafluoroborátu (DPD) s bilirubinem - tvorba azobilirubinu lHemolýza interferuje u dospělých Stanovení bilirubinu lStanovení bilirubinu celkového s derivátem kyseliny sulfámové: lNový typ diazoniové soli lReagencie se používají přímo, v analyzátoru velmi stabilní lPotlačena interference hemolýzy l lEnzymové stanovení bilirubinu přes biliverdin: lOxidace bilirubinu kyslíkem na zelený biliverdin – s bilirubinoxidasou l Měří se pokles absorbance – 424 - 465 nm l Stanovení bilirubinu přímou spektrofotometrií u novorozenců: l lAbsorbance se měří při 454 nm lMetoda nelze použít u starších dětí nebo dospělých - výsledky by mohla ovlivňovat přítomnost karotenu a jiných pigmentů l