Mikrobiologie a imunologie
Ondřej Zahradníček
Kostka

Abych se představil
lMUDr. Ondřej Zahradníček
lpovolání: klinický mikrobiolog, asistent na LF MU; učíme u nás bakalářské obory, mediky, zubaře i
studenty přírodovědecké fakulty
lbudu vám přednášet, ale nebudu vás zkoušet, to budou kolegové a kolegyně z našeho ústavu
lzájemci se u mne mohou přihlásit a mohou se přijít podívat přímo k nám

Jak se učit na zkoušku
lVe dvanácti hodinách nelze probrat totéž, na co mají studenti denní formy hodin třicet. Přesto
probereme všechna témata, jen je více či méně zkrátíme
lVíce zkrátíme ta témata, která jsou spíše „na naučení“, méně ta, která jsou spíše „na pochopení“.
lNa IS MU ve Studijních materiálech najdete nezkrácené verze prezentací
lNajdete tam také skripta ke stažení. To vše bude dostupné v průběhu semestru.

Přehled probíraných témat
lSezení 1 – 11. března 2011
–1 základní pojmy, patogenita a virulence
–2 přehled vyšetřovacích metod
lSezení 2 – 8. dubna 2011
–3 dekontaminační metody
–5 základy imunologie
lSezení 3 – 6. května 2011
–6 respirační infekce
–7 trávicí infekce
–8 močové infekce

Přehled probíraných témat
lSezení 4 – 30. května 2011
–9 STD, infekce kůže a oka
–11 infekce krevního řečiště a systémové infekce
–12 hnisavé infekce a infekce měkkých tkání
lSezení 5 – 31. května 2011
–4 antimikrobiální látky
–10 nozokomiální nákazy
lSezení 6 – 2. června 2011
–13 odběry vzorků
–14 mykologie a parazitologie

Přehled mikrobů. Patogenita a virulence
Mikrobiologie a imunologie – BDKM021, BAKM021
Téma 1
Ondřej Zahradníček
Kostka

Náš ústav
Provoz (analýza klinických vzorků)
Výuka
Výzkum
Obrázek1 PC210117
Foto: vše Archiv MU
Obrázek22

Klinická mikrobiologie a imunologie
lKlinická mikrobiologie se jako samostatný obor odštěpila začátkem 20. století z patologie. Do té
doby se diagnostikou mikrobiálních původců ve vzorcích pacientů zabývali patologové
lO více než půlstoletí později se z mikrobiologie vyčlenila imunologie, tedy věda o
obranyschopnosti organismu. Dnes už existují samostatné imunologické ústavy a laboratoře, medici
mají samostatnou zkoušku z imunologie. Klinická imunologie je však zároveň i součástí interny,
případně pediatrie.

Co nás čeká v tomto předmětu
lPovídání o klinicky významných mikrobech a jejich vlastnostech
lPovídání o určování mikrobů a vůbec o práci v laboratoři klinické mikrobiologie
lKrátké představení lidské imunity a imunologie jako takové
lA hlavně představení infekcí jednotlivých orgánových soustav, způsobů odběru vzorků, interpretace
výsledků a podobně

74 virus-ebola-Filoviridae
Ebola
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Co je to mikrob
lMusí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické
lMusí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá
lZ druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou
mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická.

35 10
Bakterie Helicobacter a kolem ní schematicky její genom
http://biology.plosjournals.org/archive/1545-7885/3/1/figure/10.1371_journal.pbio.0030040.g001-M.jp
g

Co jsou všechno mikroby
lMikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea (dříve archeobaktérie), různé
organismy schopné vydržet hluboko pod mořem nebo v extrémních podmínkách horkých pramenů
lJako klinického mikrobiologa mne tyto mikroby neživí, přesto musím uvést, že jsou zajímavé a
úžasné

Třídění živých organismů
lPriony – neobsahují DNA, většinou se vůbec nepovažují za živé organismy
lViry a bakteriofágy
lBuněčné organismy
–Archea (archeobakterie)
–Eubacteria (eubakterie)
–Eucarya (eukaryotní organismy)
ljednobuněčné
lmnohobuněčné

Klinicky významné mikroby
lKlinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo (ne tedy pro člověka =
tvůrce, ale pro člověka = objekt)
l„Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo
dokonce pomáhají
lKaždý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. Dokonce
i mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy).

20 10
Neisseria gonorrhoeae
http://medicine.plosjournals.org/archive/1549-1676/2/1/figure/10.1371_journal.pmed.0020024.g001-M.j
pg

Hlavní klinicky významné mikroby
lViry (a priony)
lBakterie (třeba streptokok nebo Escherichia)
lHouby (kvasinky a plísně)
lParaziti – přesahují pojem mikrob:
–Vnitřní paraziti
lPrvoci (třeba původce malárie)
lMotolice (třeba motolice jaterní)
lHlístice (třeba roup nebo škrkavka)
lTasemnice (třeba tasemnice dlouhočlenná)
–Vnější paraziti (vši, blechy, štěnice)

Co nás zajímá o mikrobech
morfologie
jaký mají tvar a uspořádání
struktura
z čeho se skládají
fyziologie
jak se chovají
metabolismus
jak a čím se živí
odolnost
jak vzdorují výkyvům
klasifikace
jak jsou vzájemně příbuzné

Co nás zajímá o klinicky významných mikrobech
patogenita
které orgány osidlují a jak
patogeneze
jakým způsobem případně škodí
přenos
jak se přenášejí
inkubační doba
jak dlouho trvá, než se projeví
diagnostika
jak je můžeme poznat
léčba a prevence
co proti nim můžeme dělat

Morfologie klinicky významných mikroorganismů
lViry se skládají z DNA nebo RNA a bílkovin; některé viry mají navíc membránový obal, který
„ukradly“ nějaké hostitelské buňce
lViry mají kubickou nebo šroubovicovou symetrii. Některé mají třeba tvar dvanáctistěnu. Mohou
tvořit „pseudokrystaly“
lKvasinky mají tvar vajíčka, mohou pučet a tvořit tzv. pseudomycelia. Na povrchu mají b. stěnu
lVláknité houby a paraziti jsou tvarově velice rozmanití, navíc se liší vývojová stádia

28 rhinovirus-icosaedre01
Virus
běžné
rýmy
http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Morfologie bakterií
lKoky ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích (neříkejme raději „streptokoky“ a
„stafylokoky“, bylo by to matoucí)
lTyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé,
tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté a i tyčinky můžou být různě
uspořádané
lSpirochety – tenké spirálovité bakterie
lBeztvaré bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, takže nemají tvar)

06 ECFS
Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.)
 http://www.morgenwelt.de/typo3temp/5ce14d39b5.jpg

Zprohýbaná tyčinka – helikobakter
39 helicobacter%20pylori
http://vietsciences.free.fr/nobel/medecine/images/helicobacter%2520pylori.JPG

Spirochety
11 treponema 53 kansen_02
idsc.nih.go.jp/.../k03/k03_012/k03_012.html
www.primer.ru/std/gallery_std/treponema.htm

Typ buněčné stěny
lGrampozitivní bakterie mají tlustou a jednoduchou buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně mechanicky.
Při barvení podle Grama jsou fialové. Například stafylokoky.
lGramnegativní bakterie mají tenkou, ale o to složitější buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně
chemicky. Při barvení podle Grama jsou červené. Například escherichie.
lGramem se nebarvící bakterie buněčnou stěnu nemají (mykoplasmata) nebo ji mají hodně jinou
(mykobakteria).

Grampozitivní
gm+%20cell%20wall
Gramnegativní
gm-%20cell%20wall mixed%20gram
G+
G–
http://www.arches.uga.edu/~emilyd/mibo3510/gm-%2520cell%2520wall.jpg

Fimbrie a bičíky
lMnohé bakterie jsou schopny pohybu
lK pohybu slouží hlavně bičíky
lFimbrie mohou vedle pohybu sloužit např. i k přilnutí bakterie na povrch nebo při výměně genetické
informace
lBičíky bakterií jsou úplně jiné než bičíky eukaryotních organismů

Bakterie s bičíky (Escherichia coli)
03 escherichia_coli_1
http://www.biotox.cz/toxikon/bakterie/bakterie/obr/escherichia_coli_1.htm

Pouzdro a biofilm
lPouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální
buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání
lBiofilm je souvislá vrstva, vzniklá z.bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je
mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě

lPřímý kontakt plovoucích bakterií  s povrchem
lPřilnutí na tento povrch
lRůst a shlukování těchto bakterií do mikrokolonií
lProdukce polymerové matrix
lVytvoření trojrozměrné struktury, které se říká biofilm
lBakterie regulují svůj počet pomocí takzvaného quorum sensingu
l(Podle kolegyně Černohorské z našeho ústavu)
Jak se tvoří biofilm bakterií
+

Neobarvené pouzdro
lV barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší; mikroskopista
pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo
05 Burri
http://pathmicro.med.sc.edu/fox/capsule.jpg

Sporulace
lSporulace je něco jako zimní spánek, ale mnohem dokonalejší než je zimní spánek zvířat. Opakem
spory je vegetativní forma života buňky
lSpory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně
lSpora vzniká tak, že se buňka rozdělí na dvě části. Ty se však neoddělí úplně: jedna, ze které se
stane spora, je obklopena tou druhou, které zůstává vegetativní forma. Takové spoře říkáme
endospora
lV extrémních podmínkách vegetativní buňka hyne a zůstane pouze spora
lZa příznivých podmínek spora vyklíčí
lNepleťme si spory bakterií a spory hub!

Spory různých druhů rodu Bacillus
22 Genre%20Bacillus aa
http://membres.lycos.fr/neb5000/BacteriologieI/Groupes%20Bacteriens/Batonnets%20et%20coque%20Gram-p
ositifs%20formant%20des%20endospores.htm

21 bacillus
Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví při téměř žádném barvení
www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Bugs/index.shtml

Fyziologie a metabolismus bakterií
lTak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus
lKatabolismus může být trojí:
–Fermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík.
Využívají ji například střevní bakterie
–Aerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík. Využívají ji
bakterie, které nacházíme ve vnějším prostředí, na rostlinách aj.
–Anaerobní respirace – jiný akceptor elektronů než kyslík, pro člověka málo významné

Množení bakterií
lKaždá bakterie má svou generační dobu
lZa jednu generační dobu jsou z jedné dvě, za desetinásobek je z jedné bakterie 1024 bakterií
(teoreticky) a podobně
lIdeální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali
odpadní produkty
lPozor, nepleťte si generační dobu (za jak dlouho se bakterie rozdělí na dvě) a kultivační dobu (za
jak dlouho vidíme výsledek na kultivační půdě)

Životní podmínky bakterií
lPro život bakterií jsou nutné určité podmínky
lTyto podmínky musíme splnit také v případě, že chceme bakterie uměle pěstovat (třeba proto,
abychom je přitom mohli určovat)
lNestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit
lNa druhou stranu, pokud s bakteriemi bojujeme (při desinfekci, sterilizaci), nestačí obvykle
potlačit jejich množení, ale musíme je úplně zahubit.

Životní podmínky – pokračování
lPodmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí
lNepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se
Osa působícího faktoru
Takto působí na bakterie např. různé pH (za předpokladu, že se nemění ostatní podmínky)

Interakce mikrob – makroorganismus: obecně (1)
lMezi mikrobem (mikroorganismem) a hostitelským organismem (člověk, ale i zvíře, rostlina, jiný
mikrob…) může nastat celá škála vztahů – interakcí. Může to být kooperace (člověk poskytuje
útočiště střevním escherichiím a ty se mu za to odvděčí tvorbou vitamínů), indiferentní vztah nebo
přímo antagonistický vztah.

Interakce mikrob – makroorganismus: obecně (2)
lZ hlediska klinické mikrobiologie je významný vztah mikroorganismus – makroorganismus (což může
být člověk, ale také zvíře či rostlina)
lMůže jít o symbiózu, neutrální vztah či antibiózu
lČasto se používají i termíny z potravních řetězců (komenzalismus, saprofytismus, parazitismus).
Virulentní mikroby jsou zpravidla – ale ne vždy – parazitické
lNe vždycky se dají mikroby jednoduše „zaškatulkovat“. Často záleží na okolnostech, jestli bude
mikrob „zlý“ nebo „hodný“

Interakce mikrob – makroorganismus: mikroby napadající člověka
lMikroorganismy, které napadají člověka, jsou vybaveny různými faktory virulence – jsou to faktory,
které zajišťují schopnost mikroba proniknout do organismu. Nejčastěji to bývají různé enzymy,
toxiny, bakteriální pouzdro aj.
lMakroorganismus se mikrobům brání řadou různých způsobů. Jde vždy o to, zda se více prosadí faktor
virulence mikroba, nebo mechanismus obranyschopnosti makroorganismu

Patogenita mikroorganismů
lExistují mikroby nepatogenní – neschopné vyvolat nemoc. Většinou jsou to ty, které vůbec nejsou
schopny do organismu proniknout.
lExistují mikroby podmíněně patogenní, které vyvolávají nemoci jen za určitých podmínek. Často jsou
to prospěšné bakterie, které jsou většinou „hodné“ a jen výjimečně začnou „zlobit“, když se třeba
dostanou kam nemají, nebo když zmutují
lExistují i mikroby obligátně patogenní, které vyvolávají nemoc vždy, když se dostanou do těla v
dostatečném počtu a vhodným způsobem

Předpoklady patogenity
l1) Přenosnost z hostitele (zdroje) na další organismus (osobu)
l2) Nakažlivost – schopnost narušit obranu hostitele
l3) Virulence – schopnost mikroba nějak poškodit hostitele.
lFaktory zodpovědné za virulenci, respektive patogenitu
–Kolonizace hostitele – fimbrie, bičíky, adheziny
–Faktory invazivity – vnikání do tkáně
–Toxiny (jedy), hlavně u bakterií: neurotoxiny, enterotoxiny, lokální toxiny a jiné
–Faktory boje s obrannými mechanismy hostitele
–Biofilm – složitý útvar, složený nejen z mikrobů

Patogenita a virulence
lVirulence
–okamžitá vlastnost konkrétního kmene mikroba (kmen = populace z jedné buňky)
–Kmeny tedy mohou být
–avirulentní – tedy v daném okamžiku úplně neškodné, neschopné napadat makroorganismus
–méně či více virulentní – tedy disponující různou mírou schopnosti napadnout makroorganismus.
lPatogenita
–vlastnost určitého mikrobiálního druhu
–Nepatogenní: nejsou schopny vyvolat u daného živočišného druhu nemoc (všechny jejich kmeny jsou
avirulentní)
–Potenciální (oportunní) patogeni: vyvolávají chorobu jen za určitých okolností („zvrhnou“ se,
dostanou se jinam)
–Obligátní (primární) patogeni vyvolávají nemoc "vždy"

Příklad působení patogenního mikroba
Necrotizing fasciitis


Hodné mikroby: běžná mikroflóra
lMnoho mikrobů nám pomáhá. Tím, že osidlují naše sliznice, zabrání tomu, aby je osídlily zlé
patogenní mikroby. Některé pomáhají i jinak
lNejvíc, asi kilogram, je jich v tlustém střevě
lHodně mikrobů je i v dutině ústní a v hltanu
lU žen je mikrobní ekosystém v pochvě
lI přes relativní nedostatek vody má svoji mikroflóru také kůže (poněkud se liší na různých
místech)

28 proteus1
Plazivá bakterie Proteus se podílí na likvidaci nestrávených bílkovinných zbytků potravy
http://faculty.smu.edu/ayati/proteus/proteus1.gif

Mikroflóra jako ekosystém
lKdysi lidé mysleli, že všechny škůdce úrody jednoduše zahubí například DDT. Ukázalo se ale, že
takový brutální zásah často nadělá víc škody než užitku, zvlášť když se použije nevhodným způsobem
lPodobně složitý ekosystém je i třeba střevní mikroflóra. I proto dnes na střevní infekce většinou
nedoporučujeme antibiotika, protože systém „rozhodí“ často ještě víc.

Co ovlivňuje infekci
lVstupní brána infekce (kudy mikrob pronikl)
lForma infekce
–podle rozsahu – lokální / celková
–podle vyjádření průběhu – bezpříznaková / příznaková
–u infekce s příznaky dále průběh abortivní – typický – komplikovaný
lVylučování mikrobů z těla
lV podstatě je plynulý přechod mezi infekcí, bezpříznakovou kolonizací a běžnou flórou.

Co ovlivňuje formu infekce
lna straně mikroba: vybavenost faktory virulence (může být dána třeba i tím, že mikrob sám je
napaden bakteriálním virem – bakteriofágem)
lna straně makroorganismu: stav imunity, stav anatomických bariér, hormonální rovnováha, případné
základní onemocnění a spousta dalších věcí
lforma vzájemného setkání mikroba a makroorganismu

Přehled mikrobiologických vyšetřovacích metod
Mikrobiologie a imunologie – BDKM021, BAKM021
Téma 2
Ondřej Zahradníček
C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Rodinné a jiné\Malované\Grásně a umělecké\Obdélníky a kulaté
obdélníky.bmp

Cíle mikrobiologické diagnostiky
lOdhalení původce nemoci (patogena) – pokud možno se snažíme najít opravdového původce, ne nějakého
mikroba, který se v daném místě mohl třeba objevit jen náhodou; ne vždycky je ale role mikroba
v daném infekčním procesu jasná
lNěkdy: zjištění citlivosti patogena na antimikrobiální látky (bakterie a kvasinky)
lNěkdy také: určení faktorů virulence

Co je to vzorek
lVzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře:
lkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...)
lstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média.
lPři diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny
patogenních mikrobů.

Co je to kmen
lKmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba, je to směs buněk, které pocházejí
z jedné buňky a mají všechny stejné vlastnosti
lKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě.
lKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie.

Přehled metod
lMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt
–Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem
–Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu
lMetody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem
makroorganismu

Přehled metod přímého průkazu
Metoda
Průkaz ve vzorku
Identifikace
Mikroskopie
ano
ano
Kultivace
ano
ano
Biochemická identifikace
ne
ano
Průkaz antigenu
ano
ano
Pokus na zvířeti
ano
v praxi ne
Molekulární metody
ano
v praxi ne*
*netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů

Co vidíme v mikroskopu
lV případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk
lV případě mikroskopování vzorku můžeme vidět
–mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů
–buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty
–jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně

Typy mikroskopie
lElektronová mikroskopie – u virů; spíše výzkum než při běžném průkazu virů
lOptická mikroskopie
–Nativní preparát – na velké a/nebo pohyblivé mikroby
–Nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety)
–Fixované a barvené preparáty, například:
lBarvení dle Grama – nejdůležitější bakteriologické
lBarvení dle Ziehl-Neelsena – např. u bacilů TBC
lBarvení dle Giemsy – na některé prvoky

Gramovo barvení - princip
lGrampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. Díky tomu se na ně
pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem se
neodbarví ani alkoholem. Gramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na
červeno safraninem.
Chemikálie
Grampozitivní
Gramnegativní
Krystal. violeť
Obarví se
Obarví se
Lugolův roztok
Vazba se upevní
Upevní se méně
Alkohol
Neodbarví se
Odbarví se
Safranin
Zůstanou fialové
Obarví se na červeno

Dift1 P1010003
Mikroskopie vzorku
Mikroskopie kmene
Foto: archiv MÚ

Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek)
lBakterie často pěstujeme na umělých půdách
lBakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro
bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku)
lZa 24 (někdy až 48 nebo ještě víc) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly
lVláknité houby se pěstují mnohem déle
lViry a paraziti se většinou vůbec nepěstují

Kultivace bakterií – podmínky
lBakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod.
lNěkteré jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy
lPoužíváme různá kultivační média, sloužící k.určitým účelům
lAerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry
lStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku. Kapnofilní zase zvýšený podíl CO2.

lPřipravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce
P1010008
Foto: archiv MÚ

Smysl kultivace bakterií
lProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme?
–Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na
„pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa)
–Abychom získali kmen – pouze pevné půdy
–Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící
k.identifikaci

Pojem kolonie
lKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice,
řetízku, shluku)
lKolonie je vždy tvořena jedním kmenem.
lV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji
počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU)
lPopis kolonií má významné místo v.diagnostice
S3
Foto: archiv MÚ

Kultivace v praxi
lVzorek se vloží do tekuté půdy nebo nanese na pevnou půdu
lU pevné půdy se ho snažíme tzv. mikrobiologickou kličkou rozředit, abychom získali jednotlivé
kolonie a mohli dále pracovat s.kmeny mikrobů
lTekuté půdy
–jsou půdy pomnožovací
–základem je zpravidla hovězí vývar a bílkovinný hydrolyzát
–nejdůležitější je peptonová voda, bujón, VL-bujón, selenitový bujón (selektivně pomnožovací)

Tekuté půdy
P1010001
Foto: archiv MÚ

Hemofil na ČA
Pevné (agarové) půdy
lAbychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen),
ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový
roztěr.
•Základem je opět masopeptonový bujón, ale navíc obsahují výtažek z agarové řasy. Používala se i
želatina, ale neosvědčila se tolik jako agar.
Foto: www.medmicro.info

V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie
(při dobrém rozočkování)
Rozočkování
1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až
na konci izolované kolonie

Kult5
Pevné půdy
Foto: archiv MÚ

Existují různé typy pevných půd
lDiagnostické půdy – roste "kdeco, ale různě" (krevní agar, VL krevní agar)
–Chromogenní půdy – zvláštní druh diagn. půd
lSelektivní půdy – roste "jen málo co" (krevní agar s.10 % NaCl pro kultivaci stafylokoků)
lSelektivně diagnostické půdy – např. Endova (jen G–, a rozlišení bakterií podle štěpení laktózy)
lObohacené půdy – k pěstování náročných baktérií (čokoládový agar, což je zahřátý krevní agar)
lSpeciální půdy – mají své zvláštní určení (MH půda pro testy citlivosti kmene k antibiotikům)

Pěstování anaerobních bakterií
Anae1 Anae3
Anaerobní bakterie nesnášejí kyslík. Musíme je tedy pěstovat ve speciální atmosféře bez kyslíku.
Foto: archiv MÚ
Foto: archiv MÚ

Biochemické identifikační metody
lI mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano
lBakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v
produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor
lExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů.

Možnosti praktického provedení
lRychlé testy (vteřiny až minuty)
–Katalázový test
–Testy s diagnostickými proužky (oxidáza)
lTesty s inkubací (hodiny až dny)
–Jednoduché zkumavkové testy
–Složité zkumavkové testy
–Sady jednoduchých zkumavkových testů
–Testy v plastové destičce (miniaturizace)
–Jiné testy (např. Švejcarova plotna)

Katalázový test
lKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky =
pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2
14 catalase
medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm

08 oxidase3
Příklady dalších testů:
oxidázový test (diagnostický proužek)
medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm

Provedení testu v praxi
Obrázek20
Foto: archiv MÚ

11 indole
…a další testy
15 urease2
medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm

Moderní biochemické testy zahrnují i desítky reakcí
lTesty se dělají v důlcích plastových mikrotitračních destiček.
lPočet testů v sadách kolísá od sedmi až po více než padesát
lLiší se v technických detailech. Vždy je však substrát vysušený, bakterie se nejprve rozmíchá ve
fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků

NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení
čtyř různých kmenů)
P1010002upr
Foto: archiv MÚ

Zahraniční soupravy
03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2
Foto: archiv ústavu
http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg
www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm.

Pokus na zvířeti
lPokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Jsou ale
výjimečné případy, kdy se uplatní i dnes.
newzealand7
www.rockinjawrabbits.com/newzealand.htm

Průkaz nukleové kyseliny
lmetody bez amplifikace nukleové kyseliny (klasické genové sondy)
lmetody s amplifikací (namnožením)
–PCR (polymerázová řetězová reakce)
–LCR (ligázová řetězová reakce)
lPrincipiálně se použití v mikrobiologii neliší od použití jinde (např. v genetice)
lNevýhoda – někdy jsou až příliš citlivé, takže se prokáže každá molekula DNA, která mohla třeba
„přilétnout odněkud zvenčí“. Citlivost se dnes ale dá omezit.

Metody založené na interakci antigen – protilátka
lO antigenech a protilátkách bude ještě řeč, až se budou probírat základy imunologie.
lProzatím si pouze představíme v hrubých rysech mikrobiální antigen a protilátku proti němu,
abychom si pak ukázali, jak se jejich vzájemná interakce využívá v diagnostice

Co je to protilátka
lProtilátka je bílkovina, imunoglobulin, produkt imunitního systému člověka (nebo zvířete).
lProtilátka se dá prokázat pomocí specifického antigenu, proti kterému se vytvořila
Co je to antigen
Antigen je struktura na povrchu mikroba (ale i třeba pylového zrnka či zvířecího chlupu), které
tělo provokuje k tvorbě protilátek
Antigen se dá prokázat pomocí protilátky, která se proti němu vytvořila například u zvířete

Serologické metody (založené na interakci antigen – protilátka)
lpracují s reakcí antigen – protilátka (za vzniku komplexu); vzájemně se liší způsobem detekce
komplexu antigen – protilátka
lpři stejném principu metod se dají využít pro průkaz antigenu (pomocí zvířecí protilátky) i pro
průkaz protilátky v těle pacienta (pomocí antigenu mikroba, nebo i celého mikroorganismu)

Serologická reakce v praxi
TPHA detail
+++    ++      +      +/-
  -       -       -       -
www.medmicro.info

Protilátku antigenem, nebo antigen protilátkou?
Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba.
Přímá metoda
Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta
Nepřímá metoda
Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I

Průkaz antigenu a antigenní analýza
lV rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy:
–Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku
–Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka)
lU nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky

Serologická laboratoř
Obrázek10
Foto: archiv MÚ

Čerstvá, nebo dávno prodělaná nákaza?
lPo nákaze přetrvávají protilátky dlouhodobě, někdy celoživotně. Samotný nález protilátek tedy
tolik neznamená. Pro rozlišení čerstvé × dávno prodělané nákazy se používá:
–zjištění množství protilátek (jako tzv. titru) a změna tohoto množství v čase (dynamika titru)
–rozlišení protilátek třídy IgM a IgG (jen u některých novějších reakcí je to ovšem možné)
–stanovení tzv. avidity (síly vazby protilátek)

Průběh protilátkové odpovědi
lAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM
lPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť)
lChronická infekce: různé možnosti
IgM a IgG
1
1
2
2

Ukázka serologické reakce ELISA
ELISA pro průkaz protilátek. Klikni!
Foto: archiv MÚ

Nespecifické antigeny a heterofilní protilátky
lNespecifický antigen (Paul-Bunnellova reakce): protilátky reagují s nějakým jiným antigenem než s
antigenem mikroba
lHererofilní protilátky: protilátky nejsou namířeny přímo proti mikrobu, ale proti nějaké molekule,
která se při infekci tvoří (kardiolopin u syfilis)

Přehled sérologických metod
lPrecipitace
lAglutinace (a aglutinace na nosičích)
lKomplementfixační reakce (KFR)
lNeutralizace (ASLO, HIT, VNT)
lReakce se značenými složkami:
–Imunofluorescence (IMF)
–Radioimunoanalýza (RIA)
–Enzymová imunoanalýza (EIA, ELISA)
–Imunobloty (= zvláštní případ ELISy)

Rozdíl mezi staršími a novějšími metodami
lStarší metody (aglutinace, komplementfixace, neutralizace) neumějí rozlišit protilátky třídy IgG a
IgM. Proto je tu nutno odebírat dva vzorky séra a sledovat dynamiku titru.
lNovější metody toto nepotřebují. Titry se nezjišťují, u metody ELISA se zato zjišťují hodnoty
absorbance, odpovídající intenzitě reakce (množství molekul, které reagovaly)

Práce laboratoře v praxi
lDo laboratoře přijde vzorek
lK nepřímému průkazu jsou přijímány vzorky séra (kde hledáme protilátky)
lK přímému průkazu jsou přijímány vzorky z těch míst na těle, kde předpokládáme infekci:
nejčastější jsou výtěry z krku a nosu, vzorky moče a stolice, ale někdy přijde i třeba kousek
srdeční chlopně odebraný při operaci

Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!!
U PACIENTA
LABORATOŘ
Indikace vyšetření – zda, jaké
Vlastní provedení odběru
Transport materiálu
Rozhodnutí, jak zpracovat
Vlastní zpracování materiálu
Zaslání výsledku
Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález)

Nashledanou příště…
Foto: O. Z.
C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\2007 05 19 hemošky\2005 05
19 Výběr pro atlas\P519_03sput_gnty_u2.JPG