BC_Léky_2011 1 Stanovení léků a návykových látek Petr Breinek TDM terapeutické monitorování lékových hladin •Soubor činností, jejichž cílem je optimalizovat a individualizovat další dávky léku •Součástí TDM je: - Stanovení koncentrace léčiva (příp. jeho metabolitu) v krevním vzorku, odebraného v definovaném časovém intervalu - Interpretace výsledku Proč se u některých léků stanovuje jejich koncentrace? •Hrozí jejich toxický účinek při předávkování •Některé mají úzké terapeutické rozmezí (Rozmezí mezi nejnižší koncentrací léku, při které se objevuje jeho účinek a nejvyšší koncentrací, při které se ještě neobjevuje toxický účinek léku) •Lékař pozoruje nedostatečný účinek •Je potřeba kontrolovat terapii •Je podezření, že pacient léky neužívá Obvykle monitorované léky •Imunosupresiva (cyklosporin, takrolimus, sirolimus, mykofenolát) •Antiepileptika (karbamazepin, fenytoin, kyselina valproová, fenobarbital) •Antibiotika (gentamicin, vancomycin) •Bronchodilancia (teofylin) •Kardiotonika (digoxin) •Cytostatika (metotrexát,busulfan) V některých případech se stanovují i metabolity léků. Analyzovaný materiál •Plazma •Sérum •Krev •Moč •Sliny •Mozkomíšní mok •Žluč nebo peritoneální tekutina Odběr vzorku •V ustáleném stavu (steady state) •Před další dávkou („through“) •Kdykoli („random“) •Před a po podání („peak“) Doba odběru musí být u každého léku určena + informace o pacientovi: renální funkce, čas podání, dávka Farmakologie a laboratoř 1.Klinická farmakologie odběr čas odběru interpretace výsledku konzultační činnost hlášení podezření na nežádoucí účinek léku 2.Klinická biochemie preanalytická fáze stanovení terapeutické rozmezí v případě nedostupnosti klinického farmakologa další činnosti 9 Léky jsou metabolizovány •U stanovovaných léků je jejich metabolizmus znám • •Přibližně u 20% osob probíhá odbourávání léčiv jinou rychlostí, než u většiny osob • → vzniká problém při stanovení dávky léku Co ovlivňuje hladinu léku ve stanovovaném vzorku krve? Původní látka Vstřebávání (absorpce, distribuce) Metabolismus (biotransformace) Vylučování (močí, stolicí, dechem, potem) Farmakokinetika studuje působení organismu na lék • změny koncentrace léku v těle • časový průběh koncentrací léku v plasmě Farmakodynamika studuje působení léku na organismus (orgány, tkáně, receptory) • doba účinku • stimulace • deprese • ovlivnění metabolismu 13 „Rychlí metabolizátoři“ • Přeměna léku probíhá rychleji: • - nedosáhne se terapeutické rozmezí • - účinek léku se neprojevuje • • - tato situace není tak nebezpečná: lékař zvýší dávkování léku 14 „Pomalí metabolizátoři“ • Přeměna léku probíhá pomaleji: • - množství léku v krvi přesahuje terapeutické rozmezí, i když užívá doporučené dávky • - často dochází k toxickým projevům až k poškození organismu • - závažnější stav • 15 Co to způsobuje? •dlouhou dobu se to nevědělo: • lék se vysadil nebo změnil •u pomalých metabolizátorů je to často zapříčiněno geneticky: • vrozené ,,chybění‘‘ nebo změněná funkce některého enzymu (např. cytochrom P450 se podílí na metabolismu asi 30% používaných léků) Farmakogenetika a farmakogenomika Studují individuální genetický vliv na farmakokinetiku a farmakodynamiku • Velká interindividuální variabilita • Cílem je individualizace volby léku a jeho dávkování 17 Současná praxe • •Sleduje se koncentrace léku v krvi • Pacient musí chodit na kontroly (odběry krve) •V případě problémů se upraví dávkování, či změní lék.. • • 18 Budoucnost • Začíná se sledovat: • • buď vrozené chybění • nebo změněná forma příslušného enzymu (vedoucí k pomalé přeměně léku v organismu) • 19 Metody stanovení •1. Chromatografické metody • HPLC • HPLC/MS • LC/MS • GC/MS • TLC 20 Techniky úpravy vzorků: • Extrakce kapalinou • Extrakce pevnou látkou (SPE) • Ultrafiltrace • Derivatizace • Extrakce plynem (headspace) • Adsorpce • Vymrazování 21 HPLC – jednoduché schéma • hplc Eluční činidlo Pumpa Nanesení vzorku Kolona Detektor Odpad Převodník signálu Zapisovač 22 HPLC • HPLC%201200%20Series microHPLC 23 DSCN8094 GC–TRACE GC MS – POLARISQ (Finnigan) 24 •2. Imunoanalytické metody • a) fluorescenční imunoanalýza (FIA, FPIA, DELFIA) • b) enzymová imunoanalýza (EMIT, ELISA, MEIA,CEDIA) • c) luminiscenční imunoanalýza (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,… • • 25 •3. Metody pro odhalování genetického polymorfismu v metabolismu léčiv •Lze stanovit: a)Fenotyp (rychlost transformace) b)Genotyp (analýza DNA, DNA čipy) Standardizace 26 Zkouška Referenční metoda CRM Doporučené metody Digoxin ID-MS FPIA, EIA, LIA Teofylin ID-MS FPIA, EIA, LIA, HPLC Fenytoin SRM 900 FPIA, EIA, LIA, HPLC Karbamazepin SRM 1599 FPIA, EIA, LIA, HPLC Kyselina valproová SRM 1599 FPIA, EIA, LIA, HPLC Jaká je povolená chyba v EHK? 27 Lék TMU (SEKK 2011) Lék TMU (SEKK 2011) Digoxin 24% Amikacin 30% Teofylin 27% Gentamicin 30% Primidon 24% Vankomycin 24% Fenobarbital 24% Metotrexát 30% Fenytoin 24% Karbamazepin 24% Lithium 12% Etosuximid 24% Kyselina valproová 24% Terapeutické hladiny (příklady) 28 Lék Terapeutická hladina Lék Terapeutická hladina Digoxin 0,5-1,0 µg/l Amikacin Teofylin 8,0-20,0 mg/l Gentamicin 10,4-20,9 µmol/l Primidon 5,0-12,0 mg/l Vankomycin Fenobarbital Metotrexát Fenytoin 10,0-20,0 mg/l Karbamazepin 4,0-10,0 mg/l Lithium 0,5-1,2 mmol/l Etosuximid Kyselina valproová 50,0-100,0 mg/l 29 CYKLOSPORIN A MYKOFENOLOVÁ KYSELINA •Imunosupresiva •Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) •Referenční meze: podle doby po transplantaci a druhu transplantace •Cy A: cyklický polypeptid •MPA: aktivní část z léčiva mofetil • 30 DIGOXIN • •Odběr: srážlivá krev před podáním nebo 6-11 h po podání •Referenční meze: 0,5-1,2 ug/l •Srdeční glykosid, je indikován při srdečním selhávání •DLIF (digoxin-like immunoreactive factor) •DLIS (digoxin-like immunoreactive substance) 31 TACROLIMUS •Imunosupresivum, FK 506 •obchodní název PROGRAF® •objev (1984): extrakt z houby (Streptomyces tsukubaensis) japonská farmaceutická firma Fujisawa (kódové č. FK 506) •přispívá významnou měrou k dosažení současného stupně rozvoje transplantace orgánů a buněk, používá se také při léčbě závažných autoimunitních onemocnění 32 •je 10x až 100x účinnější ve srovnání s cyklosporinem •působí inhibičně v časné fázi aktivačního procesu T lymfocytů •metabolizuje se v mikrosomech jaterních buněk (cytochrom P450) •existují i závažné nežádoucí účinky (hypertenze, nefrotoxicita,neuropatie, hepatopatie, hyperlipoproteinemie) •z toho vyplývá nutnost laboratorního monitorování lékové terapie (TDM) 33 Analyzovaný materiál •pouze krev (EDTA) •stabilita • +2 až +8°C …………14 dní • ≤ -70°C ……………. 2 měsíce • koncentrace v krvi je průměrně 35x vyšší (12-67x) než v plazmě • 34 CYKLOSPORIN A MYKOFENOLOVÁ KYSELINA •Imunosupresiva •Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) •Referenční meze: podle doby po transplantaci a druhu transplantace •Cy A: cyklický polypeptid •MPA: aktivní část z léčiva mofetil • 35 DIGOXIN • •Odběr: srážlivá krev před podáním nebo 6-11 h po podání •Referenční meze: 0,5-1,2 ug/l •Srdeční glykosid, je používán při terapii srdečního selhání a srdečních arytmií • •DLIF (digoxin-like immunoreactive factor) •DLIS (digoxin-like immunoreactive substance) 36 LITHIUM •Odběr: srážlivá krev 10-18h po podáním •Udržování terapeutické hladiny nebo určení intoxikace Li •Terapeutická hladina: 0,5-1,2mmol/l •Použití Li: léčba bipolárních chorob (duševní poruchy s cykly deprese a mánie) - profylaxe maniodepresivního onemocnění •Stanovení: nejčastěji PES (plamenová emisní spektrometrie) 37 KYSELINA VALPROOVÁ • •Odběr: srážlivá krev před podáním •Terapeutická hladina: 50,0-100,0 mg/l •Antiepileptikum (součást léků pro léčbu epilepsie), někdy používaná k léčbě migrény a bipolárních chorob) 38 FENYTOIN • •Odběr: srážlivá krev •Terapeutická hladina: 10,0-20,0 mg/l; volný fenytoin 1,0-2,0 mg/l (8-14%) •Antiepileptikum ze skupiny hydantoinů (5,5-difenylhydantoin); lék pro léčbu epilepsie; aktivní je jen volný fenytoin (většina je vázána v krvi na bílkoviny- část neaktivní) 39 Toxikologie a návykové drogy Drogový screening = detekce přítomnosti povolených i nepovolených návykových látek v biologickém materiálu (moč, vlasy, sliny, krev, pot) Důvody: • Klinické • Léčebné • Soudní • Sportovní testování Jak je vyšetření prováděno? Požadavek zní : je droga přítomna? ü První vyšetření je screeningové (nespecifické!) ü V některých případech následuje potvrzení (konfirmace) 42 •Vyšetřované skupiny návykových látek • –Amfetaminy –Benzodiazepiny –Kanabinoidy –Kokain –Opiáty – –(Psilocin a psilocybin - halucinogenní houby) –Fencylidin (CP) –LSD – – –Zákon 167/1998 Sb.O návykových látkách; –Seznam omamných a psychotropních látek Příklad testu na drogy 1.jpg 2.jpg DynexTest®SalivaScreen •Nanesení vzorku •Odečíst výsledek po 10min •Negativní výsledek: 2 proužky •Pozitivní výsledek: 1 proužek v kontrolní oblasti 1.Amfetamin 2.Metamfetamin (pervitin) 3.THC (marihuana) 4.Opiáty (morfin/heroin) 5.kokain 44 Kazetový test Jiný příklad: Kazetový test Syva®RapidTest (pozitivní na amfetaminy) Alkohol (etanol) • Plynová chromatografie (GC) • Widmarkova zkouška • Enzymové metody • Imunoanalytické metody Widmarkova zkouška nespecifická - volumetrické stanovení všech redukujících látek založené na jodometrické oxidačně-redukční titraci: 3CH3CH2OH + 2Cr2O72- + 16H+ = 3CH3COOH + 4Cr3+ + 11H2O Cr2O72- + 6I- + 14H+ = 2Cr3+ + 3I2 + 7H2O I2 + 2S2O32- = 2I- + S4O62- Enzymové stanovení etanolu Oxidace etanolu pomocí alkoholdehydrogenázy C2H5OH + NAD+ = CH3CHO + NADH+H+ (AlDH) Etanol Acetaldehyd 48 * Metamfetamin (Pervitin) * Amfetamin * Methylenedioxymetamfetamin (MDMA, Extáze) * Efedrin * Fenmetrazin, Fentermin • • •Cut-off: 1000 ng/ml •Doba záchytu v moči: MA a metabolity 3 až 5d po ukončení aplikace •Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS Amfetaminy 49 * Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam, Diazepam, Flunitrazepam, atd. • • • •Cut-off: 300 ng/ml (↓) •Doba záchytu v moči: 1 až 7d •Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS (?) Benzodiazepiny (BZD) 50 * delta-9-tetrahydrokannabinol (THC) * Cannabinol (CAN) * Cannabidiol (THC-COOH) • • •Cut-off: 50 ng/ml •Doba záchytu v moči: 1 až 3d po jednorázové dávce; až 30d u chronických uživatelů •Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS • (ve vlasech 2 až 3 měsíce) • Kanabinoidy (obsažené v marihuaně) 51 * Kokain * Crack (volá báze kokainu) • • •Cut-off: 300 ng/ml •Doba záchytu v moči: 3 až 6h; 24-6h metabolity; až 5d u chronických uživatelů •Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS Kokain 52 * Morfin * Heroin (diacetylmorfin) * Braun (hydrokodon) * Kodein * Ethylmorfin * Dihydrokodein, … • •Cut-off: 300 ng/ml (morfin) •Doba záchytu v moči: až 3d po poslední dávce •Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS Opiáty 53 Metody stanovení •1. Chromatografické metody • HPLC • HPLC/MS • LC/MS • GC/MS • TLC 54 •2. Imunoanalytické metody • a) fluorescenční imunoanalýza (FIA, FPIA, DELFIA) • b) enzymová imunoanalýza (EMIT, ELISA, MEIA,CEDIA) • c) luminiscenční imunoanalýza (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,… • •