Nádorové (tumorové) markery Petr Breinek BC_TM_2011 Úvod * Co to jsou TM? (Definice ) * Jaký je význam stanovení TM? * Rozdělení nádorů * Třídění TM * Metody stanovení * Frekvence vyšetření * Popis jednotlivých TM * Definice ØŠiroké spektrum molekul (většinou proteinů) rozdílných vlastností Ø ØMohou být produkovány nádorovými buňkami nebo jinými tkáněmi jako jejich odpověď na maligní proces Ø ØVyskytují se ve zvýšené koncentraci v nádorových tkáních nebo v krvi onkologických nemocných Ø Jaký je význam stanovení TM? ØSledování efektu terapie/průběhu choroby ØNávrat choroby (remise) ØUpřesnění diagnózy ØUrčení prognózy ØPodezření na reziduální nádor Negativní nález neznamená nepřítomnost nádoru Ø Universální tumorový marker, který by jednoznačně určil, zda jedinec má nebo nemá nádorovou chorobu není zatím znám Ø Nádorová onemocnění (rakovina) ØDruhá nejčastější příčina úmrtí ØV průběhu života onemocní v ČR rakovinou každý třetí a každý čtvrtý na ni zemře ØVyléčí se asi 47% nemocných (63% Island a Švédsko) ØLéčba v komplexních onkologických centrech Rakovina Ø Je nemoc abnormálního růstu a vývoje buněk Ø Ø Buněčný cyklus: 1.Proliferace (znásobení počtu buněk) regulována mechanismy řídícími buněčný cyklus a apoptózu (řízená buněčná smrt) 2.Diferenciace (v dospělosti je většina tkání v konečném stádiu diferenciace, nový růst vede k hyperplázii nebo k neoplázii Nádorové buňky ØNekontrovatelný růst určité části buněčné populace ØZměny v genomu/ enzymovém systému Ø ØJsou narušeny kontrolující a řídící mechanismy pro normální růst Nejvíce úmrtí ØRakovina plic ØRakovina tlustého střeva ØRakovina prsu Ø Ø Vývoj maligního nádoru a jeho zachycení 1 µg 1 mg 1 g 10-100 g 1 kg HMOTNOST NÁDORU 103 106 109 1010-1011 1012 POČET NÁDOROVÝCH BUNĚK Preklinické stadium Diagnostický práh Včasná diagnóza Pozdní diagnóza Rozdělení nádorů ØBenigní (nezhoubné) ØMaligní (zhoubné) Ø - karcinomy (epiteliální nádory) Ø - sarkomy (mesenchymální původ) Ø - hematologické nádory Ø - metastázy Ø (druhotné ložisko maligního nádoru) - Třídění tumorových markerů (podle výskytu) 1.Humorální (prokazované v krvi nebo jiných tělesných tekutinách) 2. 2.Celulární (buněčné, vyskytují se v nádorových buňkách nebo na jejich povrchu) Třídění tumorových markerů (podle biologické funkce) Ø1. Onkofetální a onkoplacentární antigeny (CEA,AFP, hCG) Ø Onkofetální antigeny – látky vytvářené organismem ve fetálním období(po narození se tvoří jen v souvislosti s nějakým onemocněním, nejčastěji nádorem) Ø Ø2. Karbohydrátové molekuly s epitopy rozpoznávané pomocí mAb (CA=carbohydrate antigen, CA125, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4) Ø3. Proliferační a diferenciační antigeny (TPS, PSA) Ø4. Hormony (hCG, ACTH, parathormon, kalcitonin) Ø5. Enzymy (NSE, TK, LD) Ø6. Specifické proteiny (ferritin, monoklonální imunoglobuliny/ paraproteiny) Ø Ø Ø7. Receptory (estrogenové, progesteronové) Ø8. Metabolity (metanefriny, katecholaminy) Ø9. Onkogeny a onkoproteiny (p53, BRCA1) Ø Onkogen ØGen buněčného nebo virového původu zodpovědný za rychlý a nekontrolovaný růst živočišných buněk (mutovaný gen) ØVznikne z protoonkogenu, který po aktivaci je schopen vyvolat neoplastickou transformaci Metody stanovení TM Ø1. Imunoanalytické metody Ø2. Stanovení enzymů Ø3. Metody chromatografické Ø4. Metody molekulární biologie Ø Další metody používané pro diagnostiku nádorů Ø Patologie Ø Histologie Ø Cytologie Ø Imunohistochemie Ø Průtoková cytometrie Ø Biofyzikální (rtg, CT, Sono, PET) ØMetody molekulární biologie Ø PCR, DNA mikroarray, proteomika Princip: FDG-PET Ø2-deoxy-2-[18F]fluor-D-glukóza Ø 18F-deoxy-fluorglukóza Ø Fluorodeoxyglukóza (FDG) Ø FDG (značená radionuklidem, rozpadajícím se za vzniku pozitronu) Ø ØPozitronová Emisní Tomografie (PET) ØNádorová buňka má při rychlém růstu velkou spotřebu glukózy Ø ØFDG je z injekční aplikaci do krve transportována do tkání jako glukóza, je fosforylována, ale nepodléhá následné defosforylaci a je tkáněmi vychytávána (fyziologicky akumulována mozkem, částečně vylučována do moči) Ø ØObraz představuje spotřebu glukózy ve tkáních PET pet Obraz představuje spotřebu glukózy ve tkáních Jaká je povolená chyba v EHK? 22 TM TMU (SEKK 2011) TM TMU (SEKK 2011) CA 125 17% NSE do 12,50 µg/l: 2,75 µg/l od 12,51 µg/l: 22% CA 15-3 18% SCCA do 3,0 µg/l: 2,75 µg/l od 3,1 µg/l: 23% CA 19-9 20% TPA do 50 U/l: 12,5 U/l od 50 U/l: 25% CA 72-4 do 3 kU/l: 0,6 kU/l od 3 kU/l: 20% PSA volný do 1,250 µg/l: 0,2 µg/l od 1,251 µg/l: 16% CYFRA 21-1 do 1,3 µg/l: 0,195 µg/l od 1,31µg/l: 20% S-100 do 0,040 µg/l: 0,008 µg/l od 0,041 µg/l: 20% AFP 20% PSA celkový 15% hCG 18% Tyreoglobulin 40% CEA 16% Β-2-mikroglobulin 35% TPS do 60 U/l: 9 U/l od 60 U/l: 15% Kalcitonin do 1000 ng/l: 30% od 1000 µg/l: 40% Doporučená přesnost stanovení ØOpakovatelnost (přesnost v sérii): <5% ØMezilehlá přesnost: <10% Ø Rozhodovací limity 24 TM Cut-off TM Cut-off CA 125 <35 kU/l NSE <16,3 µg/l CA 15-3 <25 kU/l SCCA <1,5µg/l CA 19-9 <35 kU/l TPS <83 U/l CA 72-4 <6,9 kU/l PSA celkový <2,5 µg/l (do 49r) <3,5 µg/l do 59r) <4,5 µg/l (do 69r) <6,5 µg/l (nad 59r) CYFRA 21-1 <3,3 µg/l Poměr FPSA/PSA (pro PSA: 2,5 až 10,0 µg/l) 0 až 15% malignita 15 až 25% maligní i benigní nad 25% benigní hyperlázie AFP <10 µg/l Β-2-mikroglobulin hCG ≤3 U/l (ženy) ≤6 U/l (ženy-po menopause) ≤3 U/l (muži) S-100 CEA <2,5 µg/l <5,0µg/l (kuřáci) Thymidinkináza <5 U/l ØReferenčními metodami / postupy Ø RMP Reference Method Procedure Ø ØValidovanými metodami v expertních laboratořích Ø AV Assigned Value Ø ØJako průměr výsledků měření všech účastníků po vyloučení odlehlých hodnot Ø ALTM All Laboratory Trimmed Mean Ø ØPrůměr výsledků měření stejnorodých skupin účastníků po vyloučení odlehlých hodnot Ø ConV Consensus Value Jak se získávají cílové hodnoty? 26 TM Standard AFP WHO 72/225 (BCR-486) CEA WHO 73/601 hCG WHO 3.international standard 75/537 PSA 100% FPSA; 100% PSA-ACT; směs 90% PSA-ACT a 10% FPSA Jaké jsou možnosti standardizace TM? 1.Imunoanalytické metody Ø Ø Principem je vazba mezi antigenem (TM) a k němu specifickou protilátkou (Ab) získanou imunizací nebo synteticky, případně rekombinantně (monoklonální protilátky,mAb) Ø Nejčastěji používané principy IA Ø Øa) Fluorescenční metody Ø (FIA, FPIA, DELFIA, TRACE, ..) Øb) Enzymová imunoanalýza, EIA Ø (EMIT, ELISA, MEIA, CEDIA, ..) Øc) Luminiscenční imunoanalýza Ø (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,..) Standardizace imunoanalytických metod na stanovení TM je nízká ØPříčiny: üNízká specifita používaných protilátek,které jsou orientované proti nestejným epitopům üAntigen existuje ve více izoformách üInterference Ø Epitopy a interference -Epitopy jsou oblasti antigenu, které lze rozpoznat reakcí s příslušnou protilátkou. Jsou to oligopeptidové sekvence (tvořené 15-25 aminokyselinami), přičemž jen část se bezprostředně podílí a vazbě s protilátkou. Ø -Interference může být nespecifická a specifická (souvisejícími s autoprotilátkami) skenování0007 pre2 Frekvence vyšetření TM ØPřed nasazením terapie ØPo skončení terapie Ø1 měsíc v prvním roce po primární terapii Ø2 měsíce ve druhém roce Ø3 měsíce v dalších letech sledování Øpři změně terapie ØPři nejasném průběhu nemoci Biologický poločas (TM) v séru Marker Poločas Marker Poločas CEA 14d CA 125 4d TPA 7d PSA 2d CA 15-3 7d TK 2d AFP 5d hCG 1d CA 19-9 5d SCC 0,3h Vyjadřování výsledků ØKoncentrace TM v krvi jsou velmi nízké ØVětšina TM vykazuje heterogenitu ØNeexistuje certifikovaný referenční materiál Ø Jednotky koncentrace: Ø Látkového množství (ug/l a ng/l) Ø Biologická nebo imunologická aktivita (U/l, kU/l) Ø pre Referenční rozmezí ? ØCut-off (rozhodovací limit) Ø Je to koncentrační hladina markeru, pod kterou leží většina hodnot zdravých lidí. Ø Klinické hodnocení nádorových markerů zdraví nemocní koncentrace Rozhodovací limit Ideální stav 100% specifita 100% senzitivita Klinické hodnocení nádorových markerů zdraví nemocní koncentrace Rozhodovací limit Falešně negativní Falešně pozitivní Klinická specifita Ø Udává procento správně negativních výsledků ze souboru zdravých. Ø Ø Čím vyšší specifita, tím je méně falešně pozitivních výsledků. Doporučení: >95% Klinická sensitivita (citlivost) Ø Udává procento správně pozitivních výsledků ze souboru nemocných. Ø Ø Čím vyšší sensitivita, tím je méně falešně negativních výsledků. Doporučení: >50% pre23 Významné změny hladin nádorových markerů ØBez terapie Ø výrazný nárůst koncentrace ve třech následujících odběrech ØBěhem terapie Ø nárůst o >25% progrese onemocnění Ø pokles o >50% částečná remise ØMatematicko-statistické postupy Diagnostické využití Typ nádoru Hlavní Vedlejší Tlusté střevo, rektum CEA, CA19-9 Žaludek CEA,CA72-4 CA19-9 Pankreas CA19-9, CEA CA125 Prs CA15-3, CEA CA125, TPS Ovarium CA125,CA19-9 CA72-4 Děloha SCCA, CA125 CEA Diagnostické využití Typ nádoru Hlavní Vedlejší Plíce (malobuněčný) NSE, CEA TPS Plíce (nemalobuněčný) CYFRA 21-1 SCC Germinální nádory hCG, AFP NSE Játra AFP, CA19-9 CEA Močový měchýř TPA,TPS CYFRA 21-1 Prostata PSA, FPSA Hematoonkologické TK, B2M paraprotein Zvýšené hodnoty můžeme nalézt také: ØU nemaligních onemocnění(hyperplázie prostaty-PSA) ØPo vyšetřovacích zásazích(rektální vyšetření prostaty-PSA) ØPo chirurgickém zákroku(CA 19-9, CA 125) ØPo kontaminaci analyzovaného materiálu(sliny-SCCA) ØPři akutní terapii(chemoterapie, radioterapie-TPS) ØInterference (hemolýza-NSE) ØKouření (CEA), těhotenství (hCG) ØOnemocnění ledvin a jater Možnost zvýšení hodnot TM u benigních onemocnění TM Nemaligní onemocnění Jiná příčina CEA Zánětlivé choroby jater, jaterní cirhóza, pankreatitida Kouření AFP Zánětlivé procesy plic, GIT, jaterní cirhóza, akutní a chronická hepatitida TPA Infekční procesy, jaterní cirhóza, pankreatitida CA15-3 Jaterní cirhóza, akutní hepatitida, postižení ledvinných glomerulů CA125 Ovariální cysty, choroby jater, pankreatu, žlučníku Těhotenství (1.trimestr) CA19-9 Jaterní cirhóza, cholelithiáza, chronická hepatitida, akutní a chronická pankreatitida,choroby žlučových cest, diabetes hCG Mola hydatidóza Těhotenství B2M Postižení ledvin Ferritin Záněty obecně, poruchy metabolizmu železa CYFRA21-1 Choroby urologického traktu, myomy/ovariální cysty Enzymy ØLD (laktátdehydrogenáza) ØNSE (nespecifická enoláza) ØPSA (prostatický specifický antigen) ØTK (thymidinkináza) ØACPP (prostatická kyselá fosfatáza) ØTumor M2-PK (izoenzym pyruvátkinázy) NSE (neuronspecifická enoláza) ØCytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy (katalyzuje přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát) Ø Vyskytuje se jako dimer (αγ a γγ) ØFyziologicky je produkován v nervové a plicní tkáni vyvíjejícího se plodu, v dospělosti v různých strukturách neuroendokrinního původu NSE (neuronspecifická enoláza) ØZvýšené hodnoty: Ø - malobuněčný plicní karcinom, nádory mozku (neuroblastomy) a neuroendokrinního systému (feochromocytom) ØNespecificky zvýšené hodnoty: Ø - nemaligní plicní onemocnění, Ø jaterní choroby, hemolýza, zranění mozku PSA (prostatický specifický antigen) ØFyziologicky syntetizován v epitelu prostaty u zdravých osob, ve zvýšené míře u nemocných s hyperplázií a s ca prostaty. ØGlykoprotein (10% sacharidů), působí jako serinová proteáza. ØVyskytuje se ve volné formě (FPSA) a ve formě komplexů (PSA-AMG a PSA-ACT) ØAMG=alfa2-makroglobulin ØACT=alfa1-antichymotrypsin 51 51 nZhoubný nádor prostaty je druhým nejčastěji diagnostikovaným onemocněním u mužů po 50.roce života nV průběhu roku onemocní více než 2 700 českých mužů a více než 1 300 pacientů s touto diagnózou ročně umírá nBěhem posledních třiceti let se výskyt nových případů ztrojnásobil n PSA (prostata specifický antigen) ØZvýšené hodnoty: Ø Benigní hyperlázie prostaty (BHP) a maligní hypertrofie prostaty (ca prostaty) ØNespecifické zvýšení: Ø záněty prostaty (prostatitidy), mechanické dráždění prostaty (vyšetření „per rectum“, jízda na kole) 53 53 Volný PSA (FPSA) nZvýšená specifita vyšetření nPoměr FPSA/PSA n pro „šedou zónu“ PSA 4-10 μg/l n0-15% malignita n15-25% malignita i benigní hyperlazie nnad 25% benigní hyperplazie n n TK (thymidinkináza) ØEnzym podílející se na syntéze DNA, umožňuje syntézu DNA náhradní cestou, ukazatel buněčné proliferace Øthymidin + ATP → thymidinmonofosfát Ø(ATP:thymidin-5-fosfotransferáza) Ø Ø2 izoenzymy: TK1 (fetální) v séru 95% Ø TK2 („dospělý“) TK (thymidinkináza) ØZvýšené hodnoty: Ø - hematoonkologické malignity, plicní karcinom, ca kůže ØNespecifické zvýšení: Ø - nemaligní plicní onemocnění, virové choroby, revmatické choroby, léčba některými cytostatiky (MTX) Ø Onkofetální antigeny ØAFP ØCEA AFP (alfa fetoprotein) ØSyntetizován již během vývoje plodu, mizí po porodu. Hlavním zdrojem jsou fetální játra. ØGlykoprotein (4% sacharidů) podobný albuminu, popsán 1963 ØRůzné molekulové varianty lišící se v glykosylaci ØProf.MUDr. J. Masopust Dr.Sc. AFP (alfa fetoprotein) ØSoučást screeningu vrozených vývojových vad (v 2. trimestru) ØZvýšené hodnoty: Ø - ca hepatocelulární, testes, ovaria, žaludek, pankreas ØNespecifické zvýšení: Ø hepatitidy, fyziologicky v graviditě, fetální abnormality, alkoholismus,cirhóza a selhání jater AFP (alfa fetoprotein) ØReferenční metoda: není k dispozici ØCRM: není k dispozici Ø ke standardizaci se zatím používá standard WHO 72/225 (IRMM BCR-486) Ø ØTMU: 20% ØReferenční hodnoty: <10 ug/l Ø CEA (Karcinoembryonální antigen) ØFyziologicky je syntetizován již během vývoje plodu. Hlavním zdrojem je povrch sliznic převážně v gastrointestinálním traktu a v pankreatu. ØGlykoprotein (50% sacharidů, 641 AK) ØRůzné molekulové varianty lišící se v glykosylaci, existuje >36 variant, ovlivňuje buněčnou adhezi CEA ØZvýšené hodnoty: Ø - kolorektální ca, ca žaludku, ca pankreatu, ca plic,prsa,játra ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, pankreatitida, kuřáci, alkoholismus, zánětlivé střevní, plicní a žaludeční onemocnění, hepatitidy, autoimunní choroby CEA ØReferenční metoda: není k dispozici ØCRM: není k dispozici Ø ke standardizaci se zatím používá standard WHO 73/601 Ø ØTMU: 16% ØReferenční hodnoty: <2,5 ug/l (nekuřáci) <5,0 ug/l (kuřáci) Ø Fragmenty komplexních glykoproteinů,jejichž epitopy jsou rozpoznávané monoklonálními protilátkami ØCA19-9 (také GI-CA, GI-MA) ØCA15-3 ØCA125 ØCA72-4 CA 19-9 ØIzolován z buněk kolorektálního karcinomu hybridizační technologií ØVyskytuje se jako glykoprotein ve tkáních (glykolipid) nebo v krvi (mucin) a sekretech ØPříbuzný antigenu krevní skupiny Lewis a/b ØRůzné molekulové varianty ØNení nádorově ani orgánově specifický CA 19-9 ØZvýšené hodnoty: Ø - diferencované ca pankreatu a žlučových cest, kolorektální ca, žaludek, játra ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, hepatitida, pankreatitida, onemocnění žlučových cest, diabetes,.. Ø5% populace tento antigen netvoří (krevní skupina Lewis a/b negativní) Ø CA15-3 ØGlykoprotein diferenciačního typu (ochrana epiteliálních struktur?),produkován především nádory žlázového epitelu a epitelu mléčné žlázy ØZvýšené hodnoty: Ø ca prsu, ovaria, děložního čípku, prostaty, plic a kolorektálního karcinomu ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, plicní choroby, GIT, renální poruchy CA125 ØGlykoprotein s vysokým obsahem sacharidů ØSyntetizován především v epiteliálních buňkách u ca ovárií ØZvýšené hodnoty: Ø ca vaječníků (ovárií), gynekologické tumory,ca plic, hepatocelulární karcinom ØNespecifické zvýšení: Ø gravidita, gynekologické choroby, GIT,selhání ledvin, chronické onemocnění jater CA72-4 (tumor asociovaný antigen, TAG 72 Ø ØGlykoprotein (mucinový komplex) ØZvýšené hodnoty: ca jícnu, GIT, žaludku, pankreatu, ovaria, střeva ØNespecifické zvýšení: choroby jater,ledvin,zánětlivá onemocnění, vředová choroba žaludku, GIT Fragmenty cytokeratinů ØTPS ØTPA ØCYFRA21-1 TPA (Tkáňový polypeptidový antigen) ØAntigen odpovídající solubilním fragmentům cytokeratinu 8,18,19) ØMarker proliferační aktivity nádorových buněk ØZvýšení: Ø ca ledvin,močový měchýř, plíce, prsa ØNespecifické zvýšení: Ø infekce, choroby jater, ozařování TPS (Tkáňový polypeptidový specifický antigen) ØAntigen odpovídající solubilním fragmentům cytokeratinu 18) ØMarker proliferační aktivity nádorových buněk ØZvýšení: Ø ca ledvin,močový měchýř, plíce, prsa ØNespecifické zvýšení: Ø infekce, choroby jater, ozařování CYFRA 21-1 (solubilní fragment cytokeratinu) ØEpiteliální buňky skvamózního (epidermoidního) typu ØZvýšení: Ø - ca plic, močového měchýře, cervix, žaludku,pankreatu, prostaty, hlavy a krku ØNespecifické zvýšení: Ø zánětlivá plicní onemocnění, infekce, TBC hCG (lidský choriogonadotropin) ØGlykoprotein tvořený podjednotkami alfa a beta (dimer) ØMůže docházet k disociaci na podjednotky ØBeta podjednotka může být štěpena na gonadotropinový peptid (beta-core fragment) ØStanovuje se: celkový β-hCG (dimer+volná β-podjednotka),intaktní hCG (bez volné β-podjednotky),volná β-podjednotka, beta-core fragment hCG (lidský choriogonadotropin) ØSyntetizován placentou ihned po početí ØZvýšené hodnoty: Ø choriokarcinom, ca testes ØNespecifické zvýšení: Ø těhotenství, cysty ovarií Beta-2-mikroglobulin, B2M Ø ØZvýšené hodnoty: Ø - krevní malignity (mnohočetný myelom, chronická lymfocytární anémie) Ø Nespecifické zvýšení: Ø - postižení ledvin, revmatoidní arthritis, imunodeficience Ø Monoklonální imunoglobuliny Ø ØParaproteiny Ø abnormální imunoglobuliny produkovány proliferujícím klonem plazmatických buněk, případně B-lymfocytů Ø ØVolné lehké řetězce Ø (Bence-Jonesova bílkovina v moči) 30 PROTEINE 4 IF 2 BJ Hormony a jejich metabolity ØhCG ØPTH ØACTH ØKalcitonin ØGastrin ØProlaktin ØNorepinefrin Øepinefrin Tkáňové markery Ø Molekuly receptorové povahy ØEstrogenový receptor ØProgesteronový receptor Ø (Steroidní receptory, markery ca prsu, pozitivita je indikací k terapii antiestrogeny) ØReceptor pro IL-2 ØC-erb-B2, … Možnosti cílené protinádorové terapie : Herceptin (Transtuzumab) HER2 Herceptin = monoklonální protilátka, která kompetitivně inhibuje nadměrně exprimovaný EGF-receptor erbB/HER2 vyskytující se asi u 25% ca mléčné žlázy 83 83 Závěr n n Nádorové markery nelze přeceňovat, n ale ani zatracovat. n n