Parametry metod automatické fotometrické analýzy •Každá metoda prováděná automatickým biochemickým analyzátorem má v softwaru řídícího počítače nadefinované parametry: • číslo (aplikační kód) metody • název metody • biologický materiál (sérum, plazma, moč…) • typ měření změn absorbance (end-point, kinetické měření) • délka inkubace – doba trvání reakce ( do 10 min) • měřící body reakce • vlnová délka • objem pipetovaného vzorku, • objem pipetovaných reagencií (R1, R2, R3…) • podmínky při opakování analýzy s menším, stejným nebo větším • objemem vzorku • způsob/typ kalibrace • parametry pro zajištění validní kalibrace (limity pro citlivost a • opakovatelnost) • pracovní rozsah metody a další parametry k ověření integrity • výsledku (absorbanční limit, limit pro kontrolu linearity průběhu • reakce) Parametry metod automatické analýzy •Parametry definují analytickou metodu. •Zadávají se do automatických analyzátorů •takto: •Manuální vkládání jednotlivých parametrů • ( ustupuje, možnost chyby) • •kompletní aplikace od výrobce – instalace z diskety, čárovým kódem nebo přes web, možnost úpravy pouze u některých parametrů Popis významných parametrů Vlnové délky, bichromatické měření: Všechny testy pro klinickou chemii jsou v současné době měřeny simultánně při dvou vlnových délkách – hlavní a vedlejší. sejmout0011 Bichromatické měření •Koncentrace se počítá z rozdílu absorbance obou měření. •Výhodné, neboť kompenzuje : •variace světelné emise fotometru •citlivost fotodiod •bublinky nebo částečky v cestě světla • •Hlavní vlnová délka je dána absorpčním maximem reakce •Vedlejší vlnová délka je zvolena tak, aby •rozdíl absorbancí mezi hlavní a vedlejší λ byl co největší •současně se při ní musí minimálně uplatňovat interference •současně má být co nejblíže k hlavní λ • •Na analyzátorech bývá běžně možnost využívat pro různé •metody 12 vlnových délek Měřící body reakce: •Absorbance reakčních roztoků v kyvetě je periodicky měřena po každém cyklu přístroje (kolem 20s) během reakčního času ( 3 – 10 minut) • •Přístroje jsou schopny přidávat vzorky a činidla v určité fázi reakčního času dle typu prováděného měření • •Přesná specifikace měřícím bodem sejmout0010 Typy měření: End point – jednobodové (měří se absorbance na konci reakce) sejmout0012 End point - dvojbodové (blank + konec reakce) sejmout0013 End point - tříbodové (např. pro ISE) Kinetické (rate) – měří se změna absorbance za časovou jednotku Při reakci dochází k nárůstu (stanovení CK) či poklesu absorbance (stanovení ALT, AST) sejmout0014 sejmout0003 Způsoby kalibrace: •Automatické analyzátory umožňují např. tyto typy •kalibrace: •Lineární dvoubodovou – pro fotometrické metody •Nelineární Logit-log 3P •Nelineární Logit-log 4P •Nelineární Logit-log 5P – pro turbidim. a imunoturb.m. •Nelineární exponenciální •Nelineární Spline •Isoenzym P •Isoenzym Q •Nelineární Point to Point •ISE (tříbodová) sejmout0017 sejmout0016 sejmout0007 sejmout0004 sejmout0009 sejmout0005 Ověření integrity výsledku: •Aby se zabránilo vydání nesprávného výsledku při extrémní koncentraci, analyzátory automaticky provádí zkoušky na ověření správnosti výsledku • •Není-li výsledek po technické stránce v pořádku, je označen chybovým hlášením a ve většině případů automaticky naředěn • •Používají se následující zkoušky: test na linearitu, test na dodržení absorbančního limitu, test na kontrolu vyčerpání substrátu, test detekující Hook efekt. •Test na linearitu •Je prováděn automaticky u všech kinetických metod •Linearita je kontrolována pomocí lineární regresní analýzy. Není-li splněna, vzorek je označen chybovým hlášením (př. Lin.) •Test na dodržení absorbančního limitu •Naměřená absorbance vzorku je tak vysoká, že nelze zajistit spolehlivé výsledky •U vzorků se objeví chybové hlášení (př. Lim 1) a musí se ředit •Integrita výsledku je zajištěna nastavením absorbančního limitu •Test na kontrolu vyčerpání substrátu •Uplatňuje se absorpční limit i kontrola linearity •Není-li reakce lineární, do výpočtu jsou zahrnuty pouze body z lineární oblasti sejmout0024 sejmout0006 Test detekující Hook efekt -při nadbytku antigenu u imunoturbidimetrických stanovení (Prozone Check) -koncentrace antigenu je tak vysoká, že dochází k rozpouštění precipitátu sejmout0023 Test detekující Hook efekt •Objevuje se u imunoturbidimetrických stanovení •Koncentrace ve vzorku vysoká •Leží na pravé straně Heidelbergovi křivky •Chybně stanovená nízká koncentrace měřením absorbance je s využitím Prozone Check detekována a označena chybovým hlášením •Stanovení je pak znovu provedeno z menšího objemu nebo z naředěného vzorku •Prozone Check je nejčastěji proveden následovně: Po skončení reakce se stoupající směrnicí absorbance je přidán další definovaný objem antigenu. Absorbance je měřena před i po přidání antigenu (viz 1-Point Assay) •Vyjímečně – zpravidla stačí pracovní rozsah metody • Vybrané charakteristiky automatických analyzátorů •Minimální reakční objem: •významná charakteristika analyzátoru •Odvíjí se od něj cena za analýzu jednoho testu (100 – 180 ul - pro R1 činidlo) •Některé stroje reagencie předřeďují. Pracují pak s menším objemem a minimálními náklady (Avia 1650, Siemens) • •Minimální pipetovací objem – 2 ul: •Minimální objem se týká vzorku, kontrolních a kalibračních materiálů •Reagencie jsou pipetovány proti vzorku většinou minimálně v desetinásobném nadbytku •Při potřebě provést analýzu z menšího objemu vzorku (ředění) se vzorek předředí Pořadí přidávání reakčních komponent: •Existují dva typy pipetování •1. Nejdříve se pipetuje vzorek (jehla se musí dotknout dna) a potom činidlo - př. analyzátory řady Hitachi, Roche • •2. Nejprve se pipetuje činidlo (výplach jehly vodou), potom vzorek – př. analyzátory Integra, Roche • •Jednoreagenční metody jsou označovány jako „Sample start“ a dvoureagenční jako „Substrate start“ Technický limit – výsledky, které leží mimo technický limit jsou označeny chybovým hlášením a nesmí být vydány dokud nejsou zopakovány - nejčastěji po naředění Repeat limit – výsledky jsou technicky správně, jsou pouze mimo limit zvolený laboratoří pro opakování sejmout0008 Příklady parametrů používaných u automatické analýzy: •Analyzátor na klinickou chemii: •Minimální reakční objem: 180 µl •Objem vzorku: 2 – 35 µl •Vlnové délky: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800 nm •Reakční teplota: 37°C •Reakční čas: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 minut • • •Stanovení ISE: •Metody: Na, K, Cl •Objem vzorku: 15 µl •Objem diluentu:: 450ul/vzorek •Ředění: 1 : 31 •Objem vnitřního standardu: 1050 ul/vzorek •Referenční roztok: 130 ul/vzorek •Možnost korekce na nespecifické výsledky •Existuje možnost vložit korekční faktory – např. pro kreatinin, kdy se u Jaffého metody projevuje vliv reakce proteinů • • •Sérové indexy: •Stupeň potenciální interference způsobené bilirubinem, hemoglobinem nebo lipémií lze stanovit - tzv. sérové indexy •Test je založen na měření naředěných vzorků při různých vlnových délkách Sérové indexy sejmout0015