‹#› Chromatografie_2011 1 Chromatografie Petr Breinek ‹#› 2 Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální rozdělování složek analyzované směsi vzorku mezi dvěma fázemi. • Nepohyblivá fáze (stacionární fáze) • Pohyblivá fáze (mobilní fáze) Fáze se odlišují některou fyzikálně-chemickou vlastností, např. polaritou Kvalitativní a kvantitativní stanovení 80px-Chromatography_of_chlorophyll_-_Step_7 Výsledek chromatografie chlorofylu ‹#› 3 Využití v klinické biochemii ØHbA1c ØLéky a jejich metabolity ØAminokyseliny ØMetanefriny ØKatecholaminy ØVitaminy (D2,D3,…) ØHormony ØReferenční metody ØToxikologie (screening) Tosoh_HbA1c triage ‹#› 4 • • Referenční metody • a) ID-GC/MS ID-LC/MS • standardní přidání značené močoviny (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné stanovení močoviny kombinací plynové nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií • b) HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) Např. Stanovení močoviny ‹#› 5 I. Podle skupenství mobilní fáze • Chromatografie plynová (GC; Gas Chromatography), • Chromatografie kapalinová (LC; Liquid Chromatography) Různá hlediska dělení chromatografie ‹#› 6 II. Podle uspořádání stacionární fáze • Kolonová (sloupcová) chromatografie • Kapilární chromatografie Nízkotlaká a vysokotlaká kolonová chromatografie • Tenkovrstvá chromatografie (TLC) • Papírová chromatografie Plošná kapalinová chromatografie ‹#› 7 III. Podle účelu použití • Analytická • Preparativní ‹#› 8 IV. Podle principu separace 1. Adsorpční 2. Rozdělovací 3. Iontově výměnná (ionexová) 4. Gelová (sítový efekt) 5. Afinitní ‹#› 9 Adsorpční chromatografie je založena na rozdílné adsorpci látek na povrchu sorbentu, tvořícího stacionární fázi Sorbenty používané v adsorpční chromatografii se liší svou polaritou případně kyselostí • Nepolární sorbenty (aktivní uhlí, uhlíkové sorbenty) • • Polární kyselé sorbenty (silikagel = SiO2.xH20, …) • Polární bazické sorbenty (Al2O3.xH2O, …) 80px-Chromatography_of_chlorophyll_-_Step_7 ‹#› 10 Rozdělovací chromatografie je založena na rozdílné rozpustnosti dělených látek ve dvou různých kapalinách Kapalina s butanol Kapalina m Plyn voda Cs Cm + Z Rozdělovací koeficienty (K, Rf, α) K = cs : cm ‹#› 11 Ionexová chromatografie dělení látek je založeno na schopnosti výměny iontů na pevném nosiči (matrici) Stacionární fázi tvoří tzv.ionexy (iontoměniče) Dělíme je na: Katexy (obsahují na povrchu skupiny nabité záporně a přitahují z roztoku kationty) Anexy (obsahují na povrchu skupiny nabité kladně a přitahují z roztoku anionty) Ionty ze vzorku jsou ionexem pevně připoutány a jsou nakonec uvolněny elučním činidlem ‹#› 12 Gelová chromatografie také chromatografie na molekulových sítech. Je založena na rozdílné průchodnosti otvorů na částicích stacionární fáze pro různě velké částice dělené směsi. Dělení látek na gelu je založeno na velikosti molekul a Mr. Soubor:Gelová chromatografie.png ‹#› 13 Afinitní chromatografie je založena na specifických interakcích látek s ligandem navázaným na nosič (stacionární fázi) Např.soustavy antigen-protilátka, enzym-substrát, receptor-hormon, …Typickým příkladem použití je izolace albuminu z lidského séra. Afinitní chromatografie ‹#› 14 Techniky úpravy vzorků • Extrakce kapalinou • Extrakce pevnou látkou (SPE),Solid Phase Extraction • Ultrafiltrace • Derivatizace • Extrakce plynem (headspace) • Adsorpce • Vymrazování ‹#› 15 Plošná kapalinová chromatografie Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Papírová chromatografie Soubor:Rf.png Retardační faktor RF ‹#› 16 Spíše pro kvalitativní nebo semikvantitativní metody Příklad: Toxilab (Merck) nebo Triage 6 triage ‹#› 17 Obr.3.1 Obr.3.2 Obr.3.3 Obr.3.4 Extrakce Napipetování extraktu Vložení terčíku filtr.papíru Odpaření extrakčního činidla ‹#› 18 Obr.3.5 Obr.3.6 Obr.3.7 Obr.3.8 Vložení terčíku na start Vyvíjení chromatogramu Fixace chromatogramu Barvení chromatogramu ‹#› 19 TLC_Toxilab 014 2 min 4 min 6 min 8 min Časový průběh vyvíjení chromatogramu ‹#› 20 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ‹#› 21 HPLC – přístroj • HPLC%201200%20Series microHPLC ‹#› 22 Konstrukce a hlavní součásti kapalinového chromatografu (HPLC) Vysokotlaká pumpa (v případě gradientové eluce je nutná druhá pumpa a mísič) Injektor Dělící kolona (event. i předkolona) Detektor Vyhodnocovací zařízení (zapisovač, PC, tiskárna) ‹#› 23 Eluce = promývání kolony elučním činidlem • Izokratická eluce (promývání kolony elučním činidlem stejného složení) • Gradientová eluce (během promývání kolony se složení elučního činidla mění, např. pH, poměr činidel, iontová síla,…) ‹#› 24 HPLC – jednoduché schéma • hplc Eluční činidlo Pumpa až 350 barů Nanesení vzorku Kolona Detektor Odpad Převodník signálu Zapisovač ‹#› 25 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 022a Vysokotlaká peristaltická pumpa ‹#› 26 Instr Injektor – dávkovací zařízení ‹#› 27 Instr Dělící kolona ‹#› 28 Základní pojmy Fáze Průtok (flow rate, ml/s) Retenční čas (minuty) Pík Výška píku; Plocha píku; Šířka píku Šum Drift Účinnost kolony Teoretické patro ‹#› 29 Chromatografický záznam • MycophenolicAcid Šum Nulová linie Pík Výška píku Šířka píku ‹#› 30 Teoretické patro • Výšková část kolony, ve které průměrně teoreticky dochází k jednomu rovnovážnému dělicímu kroku fyzikálně chemického jevu (např. adsorpce/desorpce u sorpční chromatografie, rozpuštění látky v zakotvené fázi a její zpětné rozpuštění nebo vypaření do mobilní fáze apod.). Netýká se ionexové a afinitní chromatografie. ·50 000 -100 000 teoretických pater na 1m délky ·(Také: minimální délka kolony nezbytná pro ustavení 1 cyklu rovnováhy mezi fázemi) ‹#› 31 Účinnost kolony ·Je úměrná počtu teoretických pater dané kolony. · ·U ionexové a afinitní chromatografie místo o účinnosti hovoříme spíše o kapacitě kolony. ·Naproti tomu zvláště u analytických kolonových chromatografií nás zajímá rozlišovací schopnost kolony, kterou charakterizujeme tzv. separačním číslem, což je, zjednodušeně řečeno, počet rozlišitelných píků mezi dvěma vybranými mezními. • ‹#› 32 Retenční/eluční čas nebo objem ·Čas od začátku eluce, který je potřebný k tomu, aby se daná frakce vzorku dostala k detektoru za kolonou, nebo objem elučního činidla, který proteče za eluční čas kolonou. · ·Jsou-li použity dobře definované kolony (např. některé komerční kolony pro HPLC nebo pro kapilární plynovou chromatografii) za předepsaných podmínek, lze retenční časy či objemy pro různé dělené látky tabelovat, neboť jsou dobře reprodukovatelné. • ‹#› 33 • UV/VIS • Detektor s diodovým polem (Diode Array Detector) • Fluorescenční • Plamenový ionizační (FID) • Elektrochemický (coulometrický, ampérometrický,….) • Hmotnostní spektrometr (MS) Detektory používané v chromatografii ‹#› Obrysy kosočtverců 34 Diodové pole mřížka bílé světlo vzorek diodové pole ‹#› 35 Kvantifikace (vyhodnocení) 1.Přímé srovnání plocha nebo výška píku a srovnání s kalibrátorem (externí standard) 2. Metoda vnitřního standardu plocha nebo výška píku srovnání poměru plochy nebo výšky píku stanovované látky s vnitřním standardem a kalibrátorem ‹#› 36 Vnitřní standard a) a)Analog stanovované látky b)Izotopem značený analyt (18O, 15N, 13C, 2H) c)Jiná vhodná látka ‹#› 37 Chromatografický záznam • MycophenolicAcid ‹#› 38 38 Chromatograf (HbA1c) Tosoh_HbA1c ‹#› 39 39 HbA0 HbA1c Val His Leu Thr Pro Glu Gluc Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser . . . . Glu Lys Ser . . . . HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce hemoglobinu Glykována je první AK - Val ß-chain ‹#› 40 40 Tosoh_HbA1c_chromatogram Tosoh_HbA1c_chromatogram2 ‹#› 41 Analyzátor aminokyselin ‹#› 42 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 022 Autosampler Mobilní fáze Ninhydrinové činidlo Kolona Detektor Pumpy ‹#› 43 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 023 Autosampler ‹#› 44 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 020 Kolona ‹#› 45 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 017 Detektor- fotodioda Průtoková kyveta Zdroj-halogenová lampa ‹#› 46 Chromatogram-AK ‹#› 47 Plynová chromatografie (GC) ‹#› 48 Dělená směs musí procházet kolonou v plynném stavu (Látka musí mít nízký b.v. nebo převedena po úpravě, nejčastěji derivatizací, na tyto látky) Plyn - Kapalina Rozdělovací Plyn - Pevná látka Adsorpční Plyn: Dusík, Argon, ….. ‹#› 49 Headspace • Těkavé látky lze z kapalných i rozmělněných pevných vzorků izolovat šetrnou extrakcí plynem,tzv.headspace techniky. Podstatou těchto metod je analýza plynné fáze, která byla v kontaktu s extrahovaným materiálem. • Statická headspace • Plynná fáze nad kapalinou nebo pevnou látkou umístěnou ve vialce uzavřené septem. Těkavé složky se rozptýlí v plynné fázi v koncentracích, které odpovídají jejich tlaku par. ‹#› 50 Příklad:Stanovení etanolu (GC) • -Krev je zahřívána ve speciální uzavřené lahvičce • -Zahřátím se etanol uvolní z krve do vzduchového prostoru v lahvičce (headspace ) • -Určitá část z tohoto prostoru je automaticky injektována do plynového chromatografu • -Před analýzou jsou vzorky krve nebo séra naředěny roztokem chloridu sodného s obsahem n-propanolu jako vnitřního standardu. Chlorid sodný zvyšuje tlak par etanolu a eliminuje rozdíly v matrici • -Plynová chromatografie je jediná metoda použitelná pro forenzní (soudní) účely sejmout0001 ‹#› 51 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 011 Vyhřívaný prostor pro kolonu Autosampler ‹#› 52 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 003 Kolona ‹#› 53 • Plamenový ionizační (FID) • Tepelně vodivostní (TCD) • Elektronového záchytu (ECD) • Hmotnostní spektrometr (MS) Detektory (u GC): ‹#› 54 GC_FID Plamenový ionizační detektor (FID) Měření změny ionizačního proudu H-plamene v důsledku přítomnosti iontů vzniklých při spálení ‹#› 55 Hmotnostní spektrometrie (MS) je analytická metoda identifikující látky podle jejich molekulových hmotností Analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty v plynné fázi ve vakuu a rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) ‹#› 56 • Hlavní součásti hmotových spektrometrů •Iontový zdroj (destrukce molekul na fragmenty) •Hmotnostní analyzátor •Detektor dopadajících fragmentů Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Vzorek Vakuum Vakuum Magnetické pole Převedení do plynné fáze Urychlení iontů ‹#› 57 Ionizace a iontové zdroje • Nárazem elektronů (EI) • Laserem (LD) - MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization = ionizace pomocí laserové desorpce s přispěním matrice) - SELDI(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization) • Elektrosprejem (ESI) • Chemická (APCI), …. ‹#› 58 MALDI-TOF ionizace c Laser b Ionty o stejné energii mají rychlosti závislé na jejich hmotnosti (m/z) TOF (Time of Flight) měření doby letu iontu ‹#› 59 Hmotnostní analyzátory Jsou tvořeny kombinací elektrických a magnetických polí nebo je separace založena na měření rychlosti iontů. • Magnetické • Kvadrupolové • Iontové pasti • Průletové (TOF) • Tandemové (MS/MS) ‹#› 60 Detektory Měření elektrického proudu vznikajícího přímým dopadem stanovovaných iontů • Fotonásobič, elektronový násobič •Lineární nebo reflektronový mód a ‹#› 61 Měření molekulové hmotnosti 1. Převedení molekul na ionty 2. Urychlení iontů z pohybu lze vypočítat poměr m/z 3. Detektor určí parametry dráhy iontů 4. Zpracování signálu a výpočet m/z 5. ‹#› 62 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 015 Iontový zdroj Kvadrupól Detektor ‹#› 63 Chromatogram ‹#› 64 Hmotnostní spektrum