‹#› LUMINISCENČNÍ metody Petr Breinek ‹#› 2 •Luminiscence = emise světla (fotonů) atomy a molekulami (luminofory), které se nacházejí v excitovaném stavu (elektron se vrací z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na nižší energetickou úroveň - do základního stavu) ‹#› 3 Bioluminiscence v přírodě medúza Světlušky, medúzy, dřevokazné houby,hlubokomořské ryby,…… Princip: Luciferin + ATP ® Luciferyl adenylát (Luciferáza) Luciferyl adenylát ® Oxyluciferin + AMP + CO2+ světlo Reakcí jedné molekuly luciferinu je produkován jeden foton o vlnové délce odpovídající namodralému světlu. Při reakci se pouhé 4 % energie mění na energii tepelnou a zbytek, tedy 96 % energie je vyzářen. Světluška je tedy daleko účinnější zářič než běžná výbojka, která má tento poměr 9:1 (tedy jen 10 % energie přechází na světlo). ‹#› 4 • Iprutokova3 ‹#› 5 Rozdělení (podle příčiny): •Fotoluminiscence (fluorimetrická stanovení) • - fluorescence • - fosforescence •Chemiluminiscence • - bioluminiscence • •Elektroluminiscence •Termoluminiscence, Radioluminiscence, Katodoluminiscence, Triboluminiscence Excitace vyžaduje zdroj světla Excitace bez zdroje světla ‹#› 6 •Použití luminiscence v KB •Imunoanalytické metody (s fluorescenčním markerem) •Fotoluminiscenční metody (fluorescenční metody) •Chromatografické metody (s fluorescenčním detektorem) ‹#› 7 •Stanovované analyty Porfyriny Hormony Tumorové markery Kostní markery Srdeční markery Vitaminy Léky Prokalcitonin,… Výhody: vysoká citlivost ‹#› 8 • Fotoluminiscence •Fluorimetrie •FPIA •MEIA •DELFIA • ‹#› 9 Fotoluminiscence •Podle dosvitu sekundárního záření dělíme fotoluminiscenci na: • fluorescenci (10-9 -10-5 s ) • fosforescenci (10-2 s až dny) •Absorbce primárního záření v oblasti gama, rentgenového,ultrafialového nebo viditelného spektra • Fluorimetrie – absorbce UV záření • ‹#› 10 Fotoluminiscence Excitační záření Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Fluorescence Zjednodušeně: je to děj, při kterém záření o kratší vlnové délce vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce ‹#› 11 Princip •1. Absorbce energie (excitace fotonem) - atomy nebo molekuly přechází do vyšší kvantové hladiny •2. Vyzáření (emise) energie formou luminiscence při návratu do základního stavu •3. Luminiscenční záření má větší vlnovou délku než záření excitační • (část absorbované energie je spotřebována přestavbami molekuly, fotochemickými reakcemi, tvorbou tepla, reakcí molekuly s okolím,…) • Rozdíl od rozptylu světla kdy nedochází k absorbci energie ‹#› 12 X + h.ν à X* à X + h.ν´ hν > hν´ potom Λ < Λ´ excitace emise Princip Stokesův posun je rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního (primárního) a emitovaného (sekundárního) záření E = h.ν = (h.c)/λ ‹#› 13 E = h.ν = (h.c)/λ E (energie fotonu) h (Planckova konstanta = 6,6262.10-34 J.s) ν (frekvence) c (rychlost světla ve vakuu 3.1010 m/s) Λ (vlnová délka) ‹#› 14 Princip (Vnitřní konverze) (Mezisystémový přechod) FLUORESCENCE FOSFORESCENCE ABSORBCE Singletový základní stav Tripletový stav Excitované singletové stavy ‹#› 15 Veličiny fluorescence •Kvantový výtěžek • poměr počtu vyzářených kvant fluorescence k počtu pohlcených fotonů •Doba života • doba mezi pohlcením kvanta budícího záření a vyzářením kvanta fluorescence •Polarizace (anizotropie) • může dát informaci o pohyblivosti molekuly fluorescenční látky v daném prostředí ‹#› 16 Přístrojová technika •Zdroj exitačního záření (Hg výbojka, halogenové výbojky, Xe výbojka, lasery). •Filtr (Woodův fitr skla s příměsí NiO, CuO, CoO). •Měřicí prostor •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál. •Detektor • ‹#› 17 ☼ Mexcit Vzorek Memis D Schéma fluorimetru excitační zdroj monochromátorexcitačního záření kyveta se vzorkem monochromátoremitovaného záření detektor ‹#› 18 Schéma fluorimetru • Fluorimetr ‹#› 19 Fluorofory = molekuly nebo jejich části, které fluoreskují •Přirozené - Aromatické aminokyseliny (v bílkovinách), např. tryptofan - NADH, riboflavin, FAD, porfyriny,… •Analytické (fluorescenční značky nebo sondy) ‹#› 20 FPIA Fluorescenční polarizační imunoanalýza Fluorescence Polarization Immunoassay •K excitaci používá polarizované světlo •Homogenní kompetitivní immunoanalýza (soutěží stanovovaný analyt a analyt značený fluoresceinem o vazebná místa na specifické protilátce) •Využívá různé rychlosti rotace velkých a malých molekul (imunokomplexu a antigenu), které vedou ke změně polarizace •Fluorescence vyvolaná lineárně polarizovaným světlem je také lineárně polarizovaná ‹#› 21 •Nutná podmínka: • •Významný rozdíl v rychlosti rotace malé molekuly antigenu a velké molekuly imunokomplexu •Použití pouze pro stanovení koncentrace malých antigenů (např. léků,…) • ‹#› 22 •Malé molekuly (stanovovaný analyt a značený analyt) se otáčejí velkou rychlostí, po excitaci polarizovaným světlem značený analyt emituje fluorescenční záření do mnoha směrů.Při detekci polarizovaného světla se naměří pouze nízká intenzita tohoto záření •Je-li značený analyt vázán na na protilátku, (imunokomplex: značený antigen-protilátka), dojde ke snížení rychlosti rotace této velké molekuly, emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – při detekci se naměří vysoká intenzita záření •Čím vyšší koncentrace stanovovaného analytu, tím více bude tohoto analytu navázáno na protilátku a tedy tím méně značeného analytu, takže naměřené hodnoty fluorescence budou nízké a naopak při nízké koncentraci naměříme hodnoty vysoké. Platí nepřímá úměra. ‹#› 23 AxSYM(Abbott) •FPIA •MEIA •ION CAPTURE •REA AxSYM AxSYM2 ‹#› 24 •Použití lineárně polarizovaného světla (l = 485 nm - zdroj wolframová lampa + polarizační filtr) •Při návratu molekuly fluoroforu do základní stavu emise zeleného světla při 525-550 nm. •Přes polarizační filtr detekce fotonásobičem. •Měření ve dvou polarizačních rovinách vektikální a horizontální poskytne výslednou intenzitu polarizovaného světla, která je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu ‹#› 25 •Soutěž molekul látky ve vzorku a téže látky značené fluoroforem o vazebná místa protilátky •Marker (fluorofor) po ozáření polarizovaným světlem emituje polarizované světlo •Polarizace je nepřímo úměrná rychlosti rotace molekuly •Rychlost rotace molekuly v kapalině je nepřímo úměrná velikosti molekuly. • ‹#› 26 Příklad kalibrační křivky stanovení amphetaminu ‹#› 27 •Je-li fluorofor vázán na velkou molekulu (komplex značený antigen-protilátka), nemůže volně rotovat a emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – polarizace zůstane zachována • •Volný fluorofor může volně rotovat, emitované světlo kmitá v jiné rovině než excitující – polarizace se zeslabuje ‹#› 28 FPIA Nízká koncentrace analytu ... vzorek značka/tracer + + Vysoká polarizace = + protilátka ‹#› 29 Vysoká koncentrace analytu ... vzorek značka/tracer + + Nízká polarizace = + protilátka ‹#› 30 MEIA Enzymová imunoanalýza na mikročásticích Microparticle Enzyme Immunoassay •Heterogenní enzymová imunoanalýza na mikročásticích •Imunokomplex značený enzymem ( ALP) •Fluorogenní substrát (MUP, 4-metylumbelliferylfosfát) reaguje s enzymem (ALP) •Defosforylace substrátu (MUP MU) • (4-metylumbelliferon), luminiscence ‹#› 31 Defosforylace substrátu •MUP MU + P + luminiscence •4-metylumbelliferyl fosfát 4-metylumbelliferon + fosfát • + luminiscence ALP Světelný zdroj: Hg-výbojka (365 nm) MU emituje fluorescenční záření(448 nm) ‹#› 32 • • • Inkubace vzorku a mikročástic s navázanou protilátkou Část reakční směsi je přenesena na matrici se skleněnými vlákny Dále je přidána protilátka značená ALP Po promytí je přidán substrát (MUP), po reakci se měří intenzita fluorescence a b c d ‹#› 33 • Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay • Protilátky nebo antigeny jsou značeny cheláty lanthanidů: Eu (europia), Sm (samaria) a Tb (terbia) DELFIA DELFIA ‹#› 34 • •Cheláty lanthanoidů vykazují po své přeměně na sloučeninu se silnou fluorescencí velký Stokesův posun a delší dobu fluorescence. •Nekompetitivní nebo kompetitivní sendvičová technika chráněná patentem. •Detekce záření ( 620 nm)se zpožděním (odstranění interferujícího záření) •Pulzní zdroj (340nm, frekvence tisíce pulzů/s) •Opakované měření (1000 a vícekrát) • ‹#› 35 •Kongenitální hypotyreóza (SKH) • Snížená funkce štítné žlázy vede ke zvýšení koncentrace TSH •Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) • Defekt steroidogeneze v kůře nadledvin; • nejčastěji deficit enzymu P450c21 (21-hydroxylázy) • zvýšení koncentrace 17 OHP (17-0H-progesteronu) • •Fenylketonurie/hyperfenylalaninémie Využití: „Celoplošný laboratorní novorozenecký screening“ ‹#› 36 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 029 Terčíky s krevní skvrnou jsou vkládány do jamek ‹#› 37 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 033 Naplnění jamek činidly ‹#› 38 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 039 Odstraněí terčíků z jamek ‹#› 39 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 040 ‹#› 40 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 041 Fluorimetr s mikrotitrační destičkou ‹#› 41 Detektor ‹#› 42 • Chemiluminiscence •CMIA •ECLIA • • ‹#› 43 •Chemiluminiscence - je vyvolána energií chemické reakce. •Termoluminiscence – je vyvolána teplem, teploty až 500 oC •Elektrochemiluminiscence • modifikace chemiluminiscence, luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky (oxidace na anodě) • ‹#› 44 Chemiluminiscence Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Luminiscence Chemická reakce A + B à X* à P + hν Vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci působením oxidantů (H2O2, O2,…) ‹#› 45 Analytické luminofory • Luminol, isoluminol • Fluorescein • Methylumbelliferon (MU) • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Cheláty lanthanidů (Europium) Nejčastěji jsou navázány jako značka (na protilátky nebo antigeny) nebo jsou použity jako substrát. ‹#› 46 Luminol •2H2O2 = 2 H2O + O2 (Peroxidáza) • •Luminol + 2H2O +O2 ®Aminoftalát +N2 +3H2O+ světlo ‹#› 47 Chemiflex™ (Abbott) Patentovaný ester akridinu Akridinium(N-sulfonyl)karboxamid Sloučenina je velmi stálá Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) f ‹#› 48 Lumigen® (Siemens) Fosfátový ester adamantyl dioxetanu Reakce: - defosforylace substrátu účinkem ALP - vznik nestabilního meziproduktu v excitovaném stavu - při jeho tvorbě je emitován tok fotonů/ luminiscence ‹#› 49 CMIA Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích •Heterogenní imunoanalýza - separace pevnou fází •Paramagnetické mikročástice •Emise světla molekulou, která je produktem chemické reakce • •Systém není ozařován zdrojem světla. ‹#› 50 I.Vzorek se přidá k paramagnetickým mikročásticím potaženými specifickou protilátkou. Analyt ze vzorku se naváže na mikročástice • (Paramagnetické částice – krystaly kysličníku železa - velký povrch a magnetické vlastnosti) •II. Po promytí se přidá konjugát protilátek proti stanovovanému analytu s luminoforem •III. Do reakční směsi se přidají roztoky H202 • (Pre-Trigger) a NaOH (Trigger) •IV. Změří se výsledná luminiscence • (v RLU jednotkách) ‹#› 51 •Intenzita záření odpovídá počtu chemiluminiscenčních molekul • (1 molekula = 1 kvantum světla) •Reakční postupy mohou být jedno nebo dvou stupňové •Kompetitivní uspořádání ‹#› 52 Paramagnetické částice potažené protilátkou + + = (Pre-Trigger) + H2O2 = + (Trigger) NaOH + Vzorek/analyt Konjugát Promytí CO2 Assay format can be either Sandwich or Competitive, 1-step or 2-step. The magnet ensures proper washing and during the optical read drags the u-pa‘s out of the way. Paramagnetic particles: mixture of metal oxides & organic polymers. The metal oxides are iron, the organic polymers those typically found in latex microparicles. The iron oxide in the u-pa causes them to be attracted to a magnet. Because the particles don‘t become magneted, when the magnetic field is removed, the particles re-disperse in solution. The specific gravity of the particles is too high to be kept in susponsion => mixing Acridinium label: acridinium amide derivatized with a sulfopropyl moiety. Upon exposure to basic pH & peroxide, the acridinium undergoes a decomposition reaction with the release o a photon of light as a product (400-500 nm). When this reaction occurs, a cyclic intermediate, is produced. Th acridinium is also no longer bound to the conjugate and is free in solution when light is emitted. To yield the Relative Luminescent Unit (RLU) for the Analyzer, the signal is summed over a period of time, usually 2-3 sec, and given as the final read result. Source: http://172.23.17.231/architect/i2000_service_manual/11031.htm (Acridinium esters are high specific-activity labels (detection limit for the label is 800 zeptomols) Tietz Fundamentals [Paramagnetic = Magnetism: an electron has both electric charge and spin => a charge in motion. This charge in motion gives rise to a tiny magnetic field. In the case of many atons, all the electrons are paired within energy levels, according to the exclusion principle, so that the electrons in each pair have opposite (antiparallel) spins and their magnetic fields cancel. In some atoms, however, there are more electrons with spins in one direction than in the other, resulting in a net magnetic field for the atom as a whole: this situation exists in a paramagnetic substance. If such a material is placed in an external field, e.e., the field created by an electromagnet, the individual atoms will tend to align their fields with the external one. The alignment will not be complete, due to the disruptive effect of thermal vibrations. Because of this, a paramagnetic substance is only weakly attracted my a magnet.] ‹#› 53 • modifikace chemiluminiscence, světlo je generováno chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky ECLIA Elektrochemiluminiscence Elecsys 2010 ‹#› 54 ECLIA •Na platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+, • Elektrochemiluminiscence Na platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+ •Cheláty ruthenia se používají jako luminiscenční značka vzniklých imunokomplexů ‹#› 55 •Na platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+, •Zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+ (má redukční vlastnosti), proto snadno redukuje Ru3+komplex na Ru2+, •Elektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny Ru-kationtu, přechodem elektronu do základního stavu dojde k luminiscenci a Ru-komplex je opět schopen další oxidace •