‹#›
Chromatografie_2011
1
Chromatografie
Petr Breinek

‹#›
2
Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální rozdělování složek analyzované směsi
vzorku mezi dvěma fázemi.
• Nepohyblivá fáze (stacionární fáze)
• Pohyblivá fáze (mobilní fáze)
Fáze se odlišují některou fyzikálně-chemickou
vlastností, např. polaritou
Kvalitativní a kvantitativní stanovení
80px-Chromatography_of_chlorophyll_-_Step_7
Výsledek chromatografie chlorofylu

‹#›
3
Využití v klinické biochemii
ØHbA1c
ØLéky a jejich metabolity
ØAminokyseliny
ØMetanefriny
ØKatecholaminy
ØVitaminy (D2,D3,…)
ØHormony
ØReferenční metody
ØToxikologie (screening)
Tosoh_HbA1c triage

‹#›
4
•
• Referenční metody
• a) ID-GC/MS  ID-LC/MS
• standardní přidání značené močoviny (izotopová diluce) do analyzovaného vzorku a následné
stanovení močoviny kombinací plynové nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií
• b) HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
Např. Stanovení močoviny

‹#›
5
I. Podle skupenství mobilní fáze
• Chromatografie plynová (GC; Gas Chromatography),
• Chromatografie kapalinová (LC; Liquid Chromatography)
Různá hlediska dělení chromatografie

‹#›
6
II. Podle uspořádání stacionární fáze
• Kolonová (sloupcová) chromatografie
• Kapilární chromatografie
Nízkotlaká a vysokotlaká kolonová chromatografie
• Tenkovrstvá chromatografie (TLC)
• Papírová chromatografie
Plošná kapalinová chromatografie

‹#›
7
III. Podle  účelu použití
• Analytická
• Preparativní

‹#›
8
IV. Podle  principu separace
1. Adsorpční
2. Rozdělovací
3. Iontově výměnná (ionexová)
4. Gelová (sítový efekt)
5. Afinitní

‹#›
9
Adsorpční chromatografie
je založena na rozdílné adsorpci látek na povrchu sorbentu, tvořícího stacionární fázi
Sorbenty používané v adsorpční chromatografii se liší svou polaritou případně kyselostí
• Nepolární sorbenty (aktivní uhlí, uhlíkové sorbenty)
•
• Polární kyselé sorbenty (silikagel = SiO2.xH20, …)
• Polární bazické sorbenty (Al2O3.xH2O, …)
80px-Chromatography_of_chlorophyll_-_Step_7

‹#›
10
Rozdělovací chromatografie
je založena na rozdílné rozpustnosti dělených látek ve dvou různých kapalinách
Kapalina s
butanol
Kapalina m
Plyn
voda
Cs
Cm
+ Z
Rozdělovací koeficienty (K, Rf, α)
 K = cs : cm

‹#›
11
Ionexová chromatografie
dělení látek je založeno na schopnosti výměny iontů na pevném nosiči (matrici)
Stacionární fázi tvoří tzv.ionexy (iontoměniče)
Dělíme je na:
Katexy (obsahují na povrchu skupiny nabité záporně a přitahují z roztoku kationty)
Anexy (obsahují na povrchu skupiny nabité kladně a přitahují z roztoku anionty)
Ionty ze vzorku jsou ionexem pevně připoutány a jsou nakonec uvolněny elučním činidlem

‹#›
12
Gelová chromatografie
také chromatografie na molekulových sítech.
Je založena na rozdílné průchodnosti otvorů na částicích stacionární fáze pro různě velké částice
dělené směsi. Dělení látek na gelu je založeno na velikosti molekul a Mr.
Soubor:Gelová chromatografie.png

‹#›
13
Afinitní chromatografie
je založena na specifických interakcích látek s ligandem navázaným na nosič (stacionární fázi)
Např.soustavy antigen-protilátka, enzym-substrát, receptor-hormon, …Typickým příkladem použití je
izolace albuminu z lidského séra.
Afinitní chromatografie

‹#›
14
Plošná kapalinová chromatografie
Tenkovrstvá chromatografie (TLC)
 Papírová chromatografie
Soubor:Rf.png
Retardační faktor RF

‹#›
15
Spíše pro kvalitativní nebo semikvantitativní metody
Příklad:
Toxilab (Merck) nebo Triage 6
triage

‹#›
16
Obr.3.1
Obr.3.2
Obr.3.3
Obr.3.4
Extrakce
Napipetování extraktu
Vložení terčíku filtr.papíru
Odpaření extrakčního činidla

‹#›
17
Obr.3.5
Obr.3.6
Obr.3.7
Obr.3.8
Vložení terčíku na start
Vyvíjení chromatogramu
Fixace chromatogramu
Barvení chromatogramu

‹#›
18
TLC_Toxilab 014
2 min
4 min
6 min
8 min
Časový průběh vyvíjení chromatogramu

‹#›
19
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

‹#›
20
Techniky úpravy vzorků
• Extrakce kapalinou
• Extrakce pevnou látkou (SPE),Solid Phase Extraction
• Ultrafiltrace
• Derivatizace
• Extrakce plynem (headspace)
• Adsorpce
• Vymrazování

‹#›
21
HPLC – přístroj
•
HPLC%201200%20Series microHPLC

‹#›
22
HPLC – jednoduché schéma
•
hplc
Eluční činidlo
Pumpa  až 350 barů
Nanesení vzorku
Kolona
Detektor
Odpad
Převodník signálu
Zapisovač

‹#›
23
Eluce = promývání kolony elučním činidlem
• Izokratická eluce (promývání kolony elučním činidlem stejného složení)
• Gradientová eluce (během promývání kolony se složení elučního činidla mění, např. pH, poměr
činidel, iontová síla,…)

‹#›
24
Konstrukce a hlavní součásti kapalinového chromatografu (HPLC)
     Vysokotlaká pumpa
(v případě gradientové eluce je nutná druhá pumpa a mísič)
   Injektor
   Dělící kolona (event. i předkolona)
   Detektor
   Vyhodnocovací zařízení
(zapisovač, PC, tiskárna)

‹#›
25
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 022a
Vysokotlaká peristaltická pumpa

‹#›
26
Instr
Injektor – dávkovací zařízení

‹#›
27
Instr
Dělící kolona

‹#›
28
Základní pojmy
Fáze
Průtok (flow rate, ml/s)
Retenční čas   (minuty)
Pík
Výška píku; Plocha píku; Šířka píku
Šum
Drift
Účinnost kolony
Teoretické patro

‹#›
29
Chromatografický záznam
•
MycophenolicAcid
Šum
Nulová linie
Pík
Výška píku
Šířka píku

‹#›
30
Teoretické patro
• Výšková část kolony, ve které průměrně teoreticky dochází k jednomu rovnovážnému dělicímu kroku
fyzikálně chemického jevu (např. adsorpce/desorpce u sorpční chromatografie, rozpuštění látky v
zakotvené fázi a její zpětné rozpuštění nebo vypaření do mobilní fáze apod.). Netýká se ionexové a
afinitní chromatografie.
·50 000 -100 000 teoretických pater na 1m délky
·(Také: minimální délka kolony nezbytná pro ustavení 1 cyklu rovnováhy mezi fázemi)

‹#›
31
Účinnost kolony
·Je úměrná počtu teoretických pater dané kolony.
·
·U ionexové a afinitní chromatografie místo o účinnosti hovoříme spíše o kapacitě kolony.
·Naproti tomu zvláště u analytických kolonových chromatografií nás zajímá rozlišovací schopnost
kolony, kterou charakterizujeme tzv. separačním číslem, což je, zjednodušeně řečeno, počet
rozlišitelných píků mezi dvěma vybranými mezními.
•

‹#›
32
Retenční/eluční čas nebo objem
·Čas od začátku eluce, který je potřebný k tomu, aby se daná frakce vzorku dostala k detektoru za
kolonou, nebo objem elučního činidla, který proteče za eluční čas kolonou.
·
·Jsou-li použity dobře definované kolony (např. některé komerční kolony pro HPLC nebo pro kapilární
plynovou chromatografii) za předepsaných podmínek, lze retenční časy či objemy pro různé dělené
látky tabelovat, neboť jsou dobře reprodukovatelné.
•

‹#›
33
• UV/VIS
• Detektor s diodovým polem (Diode Array Detector)
• Fluorescenční
• Plamenový ionizační (FID)
• Elektrochemický (coulometrický, ampérometrický,….)
• Hmotnostní spektrometr (MS)
Detektory používané v chromatografii

‹#›
Obrysy kosočtverců
34
Diodové pole
mřížka
bílé světlo
vzorek
diodové pole

‹#›
35
Kvantifikace (vyhodnocení)
1.Přímé srovnání
plocha nebo výška píku a srovnání s kalibrátorem (externí standard)
2. Metoda vnitřního standardu
plocha nebo výška píku
srovnání poměru plochy nebo výšky píku stanovované látky s vnitřním standardem a kalibrátorem

‹#›
36
Chromatografický záznam
•
MycophenolicAcid

‹#›
37
37
Chromatograf (HbA1c)
Tosoh_HbA1c

‹#›
38
38
HbA0
HbA1c
Val
His
Leu
Thr
Pro
Glu
Gluc
Val
His
Leu
Thr
Pro
Glu
Glu
Lys
Ser
. . . .
Glu
Lys
Ser
. . . .
HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce hemoglobinu

Glykována je
první AK - Val
ß-chain

‹#›
39
39
Tosoh_HbA1c_chromatogram Tosoh_HbA1c_chromatogram2

‹#›
40
Analyzátor aminokyselin

‹#›
41
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 022
Autosampler
Mobilní fáze
Ninhydrinové činidlo
Kolona
Detektor
Pumpy

‹#›
42
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 023
Autosampler

‹#›
43
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 020
Kolona

‹#›
44
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 017
Detektor- fotodioda
Průtoková kyveta
Zdroj-halogenová lampa

‹#›
45
Chromatogram-AK

‹#›
46
Plynová chromatografie (GC)

‹#›
47
Dělená směs musí procházet kolonou v plynném stavu
(Látka musí mít nízký b.v. nebo převedena po úpravě, nejčastěji derivatizací, na tyto látky)
Plyn - Kapalina Rozdělovací
Plyn - Pevná látka Adsorpční
Plyn: Dusík, Argon, …..

‹#›
48
Headspace
• Těkavé látky lze z kapalných i rozmělněných pevných vzorků izolovat šetrnou extrakcí
plynem,tzv.headspace techniky. Podstatou těchto metod je analýza plynné fáze, která byla v kontaktu
s extrahovaným materiálem.
• Statická headspace
• Plynná fáze nad kapalinou nebo pevnou látkou umístěnou ve vialce uzavřené septem. Těkavé složky
se rozptýlí v plynné fázi v koncentracích, které odpovídají jejich tlaku par.

‹#›
49
Příklad:Stanovení etanolu (GC)
• -Krev je zahřívána ve speciální uzavřené lahvičce
• -Zahřátím se etanol uvolní z krve do vzduchového prostoru v lahvičce (headspace )
• -Určitá   část z tohoto  prostoru je  automaticky   injektována do plynového chromatografu
• -Před analýzou jsou vzorky krve nebo séra naředěny roztokem  chloridu  sodného s obsahem
n-propanolu jako vnitřního standardu. Chlorid sodný zvyšuje tlak par etanolu a eliminuje rozdíly
v matrici
• -Plynová chromatografie je jediná metoda použitelná pro forenzní (soudní) účely
sejmout0001

‹#›
50
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 011
Vyhřívaný prostor  pro kolonu
Autosampler

‹#›
51
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 003
Kolona

‹#›
52
• Plamenový ionizační (FID)
• Tepelně vodivostní (TCD)
• Elektronového záchytu (ECD)
• Hmotnostní spektrometr (MS)
Detektory (u GC):

‹#›
53
GC_FID
Plamenový ionizační detektor (FID)
Měření změny ionizačního proudu H-plamene v důsledku přítomnosti iontů vzniklých při spálení

‹#›
54
Hmotnostní spektrometrie (MS)
je analytická metoda identifikující látky podle jejich molekulových hmotností
Analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty v plynné fázi ve vakuu a rozlišení těchto
iontů podle poměru hmotnosti a  náboje (m/z)

‹#›
55
Měření molekulové hmotnosti
1. Převedení molekul na ionty
2. Urychlení iontů z pohybu lze vypočítat poměr m/z
3. Detektor určí parametry dráhy iontů
4. Zpracování signálu a výpočet m/z
5.

‹#›
56
• Hlavní součásti hmotových spektrometrů
•Iontový zdroj (destrukce molekul na fragmenty)
•Hmotnostní analyzátor
•Detektor dopadajících fragmentů
Iontový zdroj
Hmotnostní analyzátor
Detektor
Vzorek
Vakuum
Vakuum
Magnetické pole
Převedení do plynné fáze
Urychlení iontů

‹#›
57
Ionizace a iontové zdroje
• Ionizace nárazem elektronů (EI)
• Desorpce laserem (LD)
- MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)
- SELDI(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization)
• Elektrosprej (ESI)
• Ionizace chemická, ….

‹#›
58
GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 015
Iontový zdroj
Kvadrupól
Detektor

‹#›
59
-TOF (Time of Flight) měření doby letu iontu
- různé zakřivení dráhy urychlených iontů v magnetickém poli

‹#›
60
Chromatogram

‹#›
61
Hmotnostní spektrum