DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay FluoroimunoanalytickáFluoroimunoanalytická metodametoda vyvinutá finskou firmouvyvinutá finskou firmou WallacWallac OyOy (LKB(LKB PharmaciaPharmacia), velmi citlivá a), velmi citlivá a specifická metoda pro stanoveníspecifická metoda pro stanovení nízkonízko-- i vysokomolekulárníchi vysokomolekulárních analytůanalytů.. využívá časově modulované měřenívyužívá časově modulované měření fluorescencefluorescence chelátuchelátu lanthanidůlanthanidů -- Europium, Terbium,Europium, Terbium, SammariumSammarium,, příp.příp.DysprosiumDysprosium.. DELFIADELFIA -- principprincip Protilátka nebo antigen jsou označeny fluorescenční sondou – chelátem lanthanidu, nejčastěji Europia Po proběhlé imunochemické reakci se ke vzniklému komplexu přidává „zesilovací“ roztok, který odtrhne Eu z komplexu a přemění jej na nový intenzivně fluoreskující chelát - fluorescence s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra (rozdíl mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence) –– Vzorek jeVzorek je pulsněpulsně excitovánexcitován zářením o vlnové délce 340zářením o vlnové délce 340 nmnm –– Fluorescence se měří vFluorescence se měří v dlouhovlnné části viditelnéhodlouhovlnné části viditelného spektra (Europium 620spektra (Europium 620 nmnm ).). DELFIADELFIA -- TimeTime--resolvedresolved fluorometryfluorometry (TRF)(TRF) - fluorescence je dlouhodobá (doba emise delší než u běžných fluoroforů řádově stovky mikrosekund) •• Fluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekFluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekundund (začíná v době, kdy už vyhasla fluorescence pozadí, která je pod(začíná v době, kdy už vyhasla fluorescence pozadí, která je podstatněstatně kratšíkratší –– nanosekundy) a samotné měření trvá také 400 mikrosekund.nanosekundy) a samotné měření trvá také 400 mikrosekund. •• Cyklus (Cyklus (pulsnípulsní excitaceexcitace -- prodlevaprodleva -- měření) trvá 1 milisekundu, běhemměření) trvá 1 milisekundu, během měření vzorku (1 sekunda) se tedy 1000x opakujeměření vzorku (1 sekunda) se tedy 1000x opakuje DELFIADELFIA -- Vysoká citlivost a specifičnostVysoká citlivost a specifičnost DELFIA Uspořádání imunochemické reakce: -- kompetitivní:kompetitivní: -- fluorescenční sondou značenýfluorescenční sondou značený antigenantigen -- intenzita fluorescence nepřímointenzita fluorescence nepřímo úměrná koncentraciúměrná koncentraci analytuanalytu veve vzorkuvzorku -- nekompetitivní (sendvičové):nekompetitivní (sendvičové): -- fluorescenční sondou značenáfluorescenční sondou značená protilátkaprotilátka -- intenzita fluorescence přímointenzita fluorescence přímo úměrná koncentraciúměrná koncentraci analytuanalytu veve vzorkuvzorku DELFIADELFIA -- současné stanovení vícesoučasné stanovení více analytůanalytů Fluorescence lanthanidů:  Úzké emisní píky při různých vlnových délkách (Eu 613 nm, Sm 643 nm)  Různá doba trvání fluorescence Eu, Sm -- Při měření se nepřekrývajíPři měření se nepřekrývají vlnové délky ani časyvlnové délky ani časy odečtu fluorescenceodečtu fluorescence EuEu aa SmSm -- umožňuje současnéumožňuje současné stanovení dvoustanovení dvou analytůanalytů DELFIADELFIA -- využitívyužití DELFIA lze použít pro široké spektrumDELFIA lze použít pro široké spektrum analytůanalytů ((v principu lzev principu lze lanthanidemlanthanidem označit každou stabilní sloučeninu obsahujícíoznačit každou stabilní sloučeninu obsahující aminoskupinuaminoskupinu):): -- ProteinyProteiny -- PeptidyPeptidy -- OligonukleotidyOligonukleotidy -- Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…)Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…) NovorozeneckýNovorozenecký screeningscreening (stanovení ze suché krevní skvrny):(stanovení ze suché krevní skvrny): -- TSH (kongenitálníTSH (kongenitální hypotyreózahypotyreóza)) -- 1717--hydroxyhydroxy--progesteronprogesteron (kongenitální(kongenitální adrenálníadrenální hyperpláziehyperplázie)) -- ImunoreaktivníImunoreaktivní trypsinogentrypsinogen IRT (cystická fibróza)IRT (cystická fibróza) DELFIA praktické provedení - Pracuje se v mikrotitračních destičkách v uspořádání 8x12 jamek se specifickou protilátkou (obvykle monoklonální) vázanou na pevné fázi DELFIADELFIA (suchá krevní skvrna) 11 Vyrážení terčíků (Vyrážení terčíků (razičkarazička)) 22 Dávkování činidelDávkování činidel 33 Inkubace, třepáníInkubace, třepání 44 Odstranění terčíků z jamekOdstranění terčíků z jamek 55 Promytí destičkyPromytí destičky 66 Měření naMěření na fluorometrufluorometru popo (vakuová(vakuová odsávačkaodsávačka) (promývačka) přidá) (promývačka) přidání zesilovacího roztokuní zesilovacího roztoku DELFIADELFIA –– suchá krevní skvrnasuchá krevní skvrna Diagnostický set obsahujeDiagnostický set obsahuje mikrotitračnímikrotitrační destičky,destičky, roztoky,roztoky, kalibrátorykalibrátory a kontroly (ve formě suché krevnía kontroly (ve formě suché krevní skvrny)skvrny) UmístěníUmístění kalibrátorůkalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků na, kontrol a pacientských vzorků na destičcedestičce kalibrátorkalibrátor kontrola pacientkontrola pacient Softwarově zpracovaná kalibrační křivka:Softwarově zpracovaná kalibrační křivka: kompetitivní uspořádání sendvičové uspořádáníkompetitivní uspořádání sendvičové uspořádání DELFIA xx AutoDELFIA „Manuální“ linka DELFIA Analyzátor AutoDELFIA Metodu DELFIA lze plně automatizovat při práci s kapalným materiálem (plasma, sérum). Při práci se suchou krevní skvrnou není dosud běžná automatizace prvního kroku (vyrážení terčíků).