Moderní metody analýzy genomu Čipové technologie I 3.3.2011 Jitka Malčíková FN Brno_modra_ctverec LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Lékařská fakulta MU Logo CMBGT_verze 5 final zakladni_CZ Princip čipových technologií §Princip – sondy vázané na nosný podklad § § §Různé dělení podle úAplikace (genotypizace; exprese RNA, proteinů; epigenetika…) úTechnologie výroby (in situ syntéza; deponování) úTypu sond (umělé chromozómy – BAC, PAC; cDNA; oligonukleotidy) úZnačeni (fluorescence – jedno/více-kanálové; autoradiografie, chemiluminiscence) Nosný podklad §Sklo úmikroskopické sklíčko (25 x 75 mm) úspeciální formáty úrůzné úpravy povrchu – aminosilan, epoxy atd. §Nylonová nebo nitrocelulózová membrána §Plast, gel §Mikrokuličky úBeadArrays® (Illumina) úxMAP (Luminex) Aplikace §Analýza genomových aberací, genotypizace úCGH, SNP čipy úResekvenační čipy ú §Epigenomika úMapování vazby proteinů na DNA (ChIP-on-chip) úMapování metylované DNA (MeDIP-chip) ú §Exprese úmRNA, miRNA úProteiny úBuňky, tkáně Čipy pro analýzu genomu §Výchozí materiál - genomová DNA § §Detekce nebalancovaných genomových změn úAmplifikace, delece – CNV – copy number variations úNedetekuje balancované chromozomální translokace úArray CGH ú §Detekce uniparentální dizomie, genotypizace úSNP čipy ú §Detekce mutací, polymorfismů úResekvenační čipy § Postup §Izolace DNA §Kontrola kvality, stanovení kvantity §Amplifikace – celogenomová, PCR §Fragmentace – enzymaticky §Značení - fluorescence §Hybridizace, odmytí §Skenování §Analýza dat CGH - komparativní genomová hybridizace § § Kohybridizace značené DNA vzorku a kontrolní DNA www.advalytix.com (Beckman Coulter) §na sondy navázané na sklíčku úarray CGH – čipová technologie §na normální metafázní chromozomy úklasická CGH, HR-CGH úMetoda molekulární cytogenetiky CGH CGH_vysledek http://web.ncifcrf.gov (NCI-Frederick) Klasická CGH, HR-CGH Rozdělení aCGH podle typu sond § §Délka a hustota pokrytí DNA sond určuje rozlišení čipu § §Úseky genomové DNA vložené do vektorů úYAC (Yeast Artificial chromosome) - 200 -1000 kb úBAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50–200 kb úPAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb úKosmidy – 30-40 kb úRozlišení ~ 1Mb ú §cDNA - 1-2 kb úPouze genové oblasti úHorší schopnost detekce jednokopiových změn úRozlišení - 1-2 kb ú §Oligonukleotidy - 25-85 bazí úRozlišení - pod 1 kb ú ú Platformy aCGH §Cílené úAnalýza vybraných „hot spot“ oblastí spojených s konkrétním onemocněním ú §Chromozomové § §Celogenomové úSondy rozmístěné úrovnoměrně po genomu úv určitých intervalech úTilling arrays – sondy se překrývají – vysoké rozlišení § Davies et al., 2005 Výsledky aCGH Nimblegen 2,1M Krátká delece mono a bialelická SNP čipy § §Čipy umožňující rozlišit nejen CNV, ale i SNP úSondy pro detekci CNV jako u CGH čipů + sondy speciálně navržené pro detekci SNP ú §SNP – jednonukleotidové polymorfismy úV lidském genomu asi 10 mil identifikovaných polymorfismů úAsociace s onemocněními § §Určení alelového statusu, haplotypu úGenotypizace, asociační studie § §Detekce uniparentální dizomie SNP www.marshall.edu Uniparentální dizomie (UPD) CNN LOH – copy number neutral loss of heterozygozity úVrozená, získaná úVyskytuje se u řady onemocnění mutace monozomie trizomie UPD Normální karyotyp * Princip SNP čipů - Affymetrix § § §25b sondy, záměna 13. nukleotidu §Jednobarevná detekce úna čip se hybridizuje pouze označená testovaná DNA Princip SNP čipů - Illumina ú1x 50b, single base extension; pouze A/G, A/C, T/C, T/G (dvoubarevná metoda) ú2X 50b, allele specific extension ú ú § Princip SNP čipů - Agilent §60b, SNPs pouze v místech rozpoznávaných restrikčními endonukleázami § Výsledky SNP čipů amplifikace + delece + bialelická delece Uniparentální dizomie Využití CGH, SNP čipů §Nádorová genomika úV nádorových buňkách často změny genomu – primární i sekundární §Klinická genetika úPřesnější charakterizace mikrodelečních syndromů úIdentifikace genomových změn u pacientů s mentální retardací i jinými vrozenými postiženími §Farmakogenomika §Prenatální a preimplantační diagnostika §Asociační studie – asociace SNP i CNV s řadou onemocnění (revmatoidní artritida, diabetes, nádorová onemocnění, psychiatrická onemocnění) §Evoluční studie § Resekvenační čipy §Affymetrix úStejný princip jako detekce SNP úKrátké oligonukleotidy – 25mery úTypizovaná báze na 13. pozici – největší vliv na sílu vazby při neshodě úSNP = testovány 2 varianty X resekvenování = testovány 4 varianty Resekvenační čipy Affymetrix - princip Resekvenační čipy Affymetrix §Sekvenace mnoha kb současně § § § §Citlivost - 10-25% mutované DNA §Problematické oblasti – GC bohaté, repetitivní §Náš design - CLL specifický čip ú50kb ú8 genů (m.j. ATM – 62 exonů), 110 miRNA § Format 49 100 169 Sequence Capacity 300 kb 100 kb 50 kb Resekvenační čipy - postup 100 long range PCR ~ 5kb Protokol - 3 dny Resekvenační čipy - výstup Nutné ověřit sangerovým sekvenováním Resekvenační čipy §APEX úArrayed Primer EXtension ú4-barevná technologie – nutné speciální vybavení úProdloužení sondy o jeden nukleotid komplementární ke vzorku § Resekvenační čipy - závěr §Paralelní sekvenace více oblastí §Detekce mutací, na které je čip navržen §Screeningová metodika § §Komerčně dostupné „diagnostické“ čipy úRoche – platforma Affymetrix Cytochrom P450 – FDA approval, CE-IVD P53 v testování Není nutné ověřovat výsledek Jen 1 gen , ale velmi rychlé, „user friendly“ (protokol max 2 dny) úAPEX Dostupné čipy pro konkrétní geny + možný vlastní design Nutné ověřit sekvenací Research use only ú §