LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie
Moderní metody analýzy genomu
Aplikace I
21.4. 2011
Boris Tichý
Aplikace nových technologií
Celogenomový screening
Sekvence
SNP
Strukturní aberace, početní aberace
Cílený screening
Sekvence
SNP
Analýza DNA
Cílený screening
Target enrichment
Hybridizace
na čipu
v roztoku
PCR
běžná
mikrofluidní
Exome sequencing
Všechny exprimované geny
Většinou včetně nekódujících
Hybridizace (v roztoku)
Gene enrichment
Jeden gen – např. dědičné poruchy
PCR, hybridizace
multiplexing
Skupiny genů – např. multifaktoriální nemoci, nádory
PCR, hybridizace
Úseky genomu – strukturní aberace
hybridizace
Deep sequencing
Germinální mutace/SNP
Heterozygot – 1:1
Mozaika – variabilní
Somatické
Různý poměr zdravých/postižených buněk
Jednotlivé subpopulace postižených buněk (např. nádorových)
=> Deep sequencing
Sekvenování s vysokým pokrytím
! max. senzitivita dána chybovostí enzymů
CMBGT - plány
a) dědičné poruchy
Často velmi dlouhé geny
(např. Duchenova muskulární dystrofie – dystrofin – 79 exonů, 2,4Mb, 14kb mRNA)
=> >150 sekvencí (forward + reverse)
=> 150*3€/pacient
GS Junior
75.000 reads => 500 reads/amplikon => 4-5 vzorků/běh
1.500€/běh
MiSeq
Kapacita ~1 mld. bazí =~ 3 mil. reads
Dystrofin – 14.000 bazí => ~150 reads po 100 bazích
=> 100x pokrytí → 15.000 reads
=> 200 vzorků/běh
1-2.000€/běh + náklady na enrichment !(150 – 1.000€/vzorek)!
Více genů – stejná situace
CMBGT - plány
b) leukemie/lymfomy
“kontaminace” vzorku nenádorovými (zdravými) buňkami
klonální evoluce nádoru
somatické mutace
=> hledáme metodiku pro de novo detekci mutací s citlivostí pod 1% buněk s aberací
=> resequencing microarray
=> deep sequencing
CMBGT - plány
b) leukemie/lymfomy
resequencing microarray
krátké oligonukleotidy (25 bazí)
udávaná citlivost až 1 %
9 genů, 120 miRNA (~ 40 kb sekvence)
110 long-range PCR
potřeba analyzovat desítky vzorků ← optimalizace algoritmu
neanalyzovatelné úseky (GC, homopolymery,...)
variabilní sezitivita
falešné pozitivní/negativní nálezy – problematické ověření
b) leukemie/lymfomy
Deep sequencing
Sekvenování s vysokým pokrytím
Enrichment?
Hybridizace
PCR
Long-range PCR, multiplex PCR
Vyhodnocení
Vhodný SW
Statistický model?
CMBGT - plány