Patofyziologie – cvičení (jaro 2011) Metody molekulární biologie Mgr. Petra Linhartová peta.linhartova@gmail.com Doporučená literatura n nŠmarda J. a kol.: Metody molekulární biologie. Brno 2005 n nAlberts, Bruce: Základy buněčné biologie : úvod do molekulární nbiologie buňky : Essential cell biology (Orig.). n nRosypal, Stanislav: Úvod do molekulární biologie n nRosypal S. a kol.: Terminologie molekulární biologie. Brno, 2001. n nMazura I. a kol.: Speciální metody molekulární biologie. Praha, n2001. n Průběh cvičení n1) Teoretický část -Metody molekulární biologie -Využití molekulárně biologických metod n (MUDr. Vendula Bartáková) n n2) Praktická část -Polymerázová řetězová reakce (PCR) -Izolace NA (Mgr. Veronika Tanhäuserová) -RealTime PCR (Mgr. Marián Hlavna) -Sekvenování (Mgr. Jolana Lipková) -Tkáňové kultutry (Mgr. Katarína Kuricová) - Základní pojmy nDNA nbáze ngen nlokus nalely - dominantní - recesivní nhomozygot nheterozygot n ngenom ngenotyp nfenotyp n Struktura a organizace genu Lidský genom nHGP 2001 n3.109 bp n21000 ± 1000 genů nsekvence n - jedinečné n - repetitivní n a) tandemové §satelity – 20bp-kb §minisatelity – 10-20bp §mikrosatelity – 1-5bp, nejčastější n b) rozptýlené §krátké (SINE) př.Alu §dlouhé (LINE) př.L1 DNA-HIGH PCR npopsal v r. 1983 Kary B. Mullis, 1993 NP n nprincip: enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (denaturace, annealing, extenze) n nvýsledek: počet kopií dané sekvence DNA- 2n (n-počet cyklů) n nkomponenty reakční směsi pro PCR: ¨voda ¨pufr ¨dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGT) ¨MgCl2 ¨termostabilní DNA polymeráza (např. Taq z bakterie Thermus aquaticus) ¨oligonukleotidové sondy (“primery”) - specifická Ta ¨templátová DNA PCR nteplotní režim (v termocykleru): ¨1) 95ºC 2‘ iniciální denaturace ¨2) 96ºC 30‘‘denaturace ¨3) 40-72ºC 20‘‘ annealing ¨4) 72ºC 30‘‘ elongace nkroky 2 – 4 celkem 30x ¨5) 72ºC 5‘ závěrečná elongace ¨6) 4ºC 10‘ zchlazení n c7_20_7_pcr http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU&feature=related Elektroforéza nseparace NA v elektrickém poli v gelu na základě rozdílného n náboje (amino- či fosfátových skupin) a velikosti ¨gel z agarózy (horizontálně) ¨ - lineární polymer z řasy Agar agar ¨ ¨ ¨ nLoading buffer: n - Ficoll - hustý, drží vzorek na dně n - bromfenolová modř - vizualizace n n ¨ n img80 D-galaktosa 3,6-anhydro L-galaktosa http://img.guidechem.com/casimg/26873-85-8.gif Ficoll Elektroforéza Trideni v gelu http://www.madsci.org/posts/archives/1999-02/919869466.Mb.1.jpg nDNA nutno vizualizovat - fluorescenční barviva - ethdiumbromid (EtBr) n UV světlo 590nm, kancerogen, mutagen, teratogen! nsrovnání velikosti produktů a standardu n n n ¨ n Elektroforéza all equiptment Vanička ä Hřebínky ä Zdroj Vana åKryt vany Elektrické vodiče â Modifikace PCR nReverzně transkripční PCR nPCR RFLP nAlelově specifická PCR nPCR VNTR nRealTime PCR nNested PCR - nejprve amplifikace genomické DNA - v další PCR reakci je templátem produkt reakce předcházející - zvyšování specifity nMultiplex PCR - detekce několika genů součastně v jedné reakci - detekce deletovaných exonů u Duschenovy muskulární dystrofie 2. Reverzní transkripce cDNA (PCR templát) 3. PCR 1. Vyšetřovaná RNA nukleotidy primer Reverzní transkriptáza Kopie mRNA - analýza genové exprese - detekce infekčních agens - detekce genetických chorob RT PCR = reversně transkripční PCR - amplifikace RNA -RNA-dependentní DNA-polymeráza -eliminace intronů – poskytuje informace o alternativním sestřihu - PCR RFLP = analýza délky restrikčních fragmentů - analýza DNA pomocí specifického štěpení restrikčními endonukleázami (RE) - RE - enzymy bakterií vyvinuté během evoluce k štěpení cizí DNA - název odvozen dle jejich původce - např. EcoRI (E.coli) - rozpoznávací specif. oblast 5´-CCT GßAATTC AGG-3´ 3´-GGA CTTAAÝG TCC-5´ - štěpí vnitřní fosfodiesterové vazby - schopny rozpoznat a štěpit JEN specifické sekvence (zamezení bakt. narušení vlastní DNA) - RE mají specifickou teplotu, při které štěpení probíhá optimálně - využití - při detekci určité mutace Alelově specifická PCR -ve dvou nebo více paralelních reakcích - 3 druhy primerů VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) -označuje variabilní počet tandemových opakování, neboli polymorfní úsek DNA (lokus), který je vytvořen tandemovým uspořádáním mnohočetných kopií krátkých sekvencí DNA. -lokus má v populaci několik alel Hybridizace NK nv roztoku nna pevných podkladech ¨obvykle nitrocelulózový filtr nebo nylonová membrána ¨přenos po elektroforetické separaci nkapilárni přenos nelektroforetický přenos nvakuový přenos ¨typ přenášených molekul nDNA - Southernův přenos nRNA - Nothernový přenos nproteiny - Westernový přenos ¨prehybridizace (obsazení volného místa na membráně) – hybridizace (ponoření membránydoroztoku s jednořetězcovou sondou) – promývání nenavázané sondy – detekce sondy nv preparátech chromozomů, buněk a tkání (in situ) ¨ fluorescenční in situ hybridizace (FISH) southernblot_1 southernblot Southernův přenos ntvorba souboru identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA (klonů DNA) např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo pomocí PCR (in vitro) n nrekombinantní DNA vznikne spojením inzertu (cizorodé DNA) s vektorem naplikace ¨studium funkce izolovaných genů ¨studium regulačních oblastí genů ¨fyzikální a genetická analýza genomů ¨exprese cizorodých genů a tvorba rekombinantních proteinů image Klonování DNA npostup ¨příprava inzertu ngDNA, cDNA, PCR produkt ¨přenos inzertu do vektoru ntransformace, elektroporace ¨selekce klonů obsahujících inzert ninzerční inaktivace,alfa-komplementace n nklonovací vektory ¨plazmidové (2-15kb) ¨fágové (37-52kb) ¨kosmidy - hybridy mezi plazmidy a fágy(32-47kb) n n bacterial_transformation_large.jpg Klonování DNA nhttp://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=related Microarray Děkuji za pozornost Využití metod molekulární biologie v praxi MUDr. Vendula Bartáková PCR_tubes Oblasti využití metod molekulární biologie •farmakogenomika/farmakogenetika •kriminalistika •prenatální/preimplantační diagnostika •určování pohlaví •určování paternity •identifikace onkogenů •detekce patogenů •evoluční genetika • Farmako-genetika x genomika •farmakogenetika se zabývá hledáním vztahu mezi metabolismem, případně efektivitou léčiva a přítomností jednotlivých genetických variant (polymorfismů) genů, které se na absorbci, distribuci, metabolismu, eliminaci podílejí •farmakogenomika zkoumá vztah účinku léku na úrovni celého genomu, resp. transkriptomu •screening známých genových polymorfismů •účelná farmakoterapie, minimální nežádoucí účinky Polymorfismy důležité pro farmakogenetiku •V genech kódujících: • •enzymy lékového metabolismu •membránové transportní přenašeče •receptorové proteiny •proteiny iontových kanálů leky Metodiky stanovení genových polymorfismů •polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) •PCR •real-time PCR •polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) •sekvencování •DNA čipy gene-dna-climb Kriminalistika • •využití molekulárně biologických metod od 2. pol. 80. let •porovnání DNA z biologického materiálu zajištěného na místě činu (krev, sliny, sperma, vlas) a DNA podezřelých osob •větší spolehlivost než metody sérologické (využívány od počátku 20.století) - molekula DNA je daleko stabilnější než antigeny a enzymy zbran sherlock-holmes Získání vzorku, využití • •izolace DNA ze slin, krve, kosti či vlasu •amplifikace DNA •analýza namnožené DNA na sekvenátoru - výsledný profil DNA polymorfismů •celá analýza DNA vyjde přibližně na 1000 Kč - jeden vzorek • •zjišťování shody - porovnává se DNA z biologické stopy s DNA jedné či několika osob, aby se zjistilo, ze které osoby materiál pochází •zjišťování příbuznosti - porovnává se DNA několika osob, aby se potvrdila či vyloučila možnost příbuzenského vztahu • vlasy kapka krve Identická dvojčata Antibody Profile Essay •test, který využívá komplexní soubor antigenů, přichycených na proužku membrány, které zachytí a rozluští protilátky ze vzorku •vzorek krve je nanesen na testovací proužek, který se následně promyje speciálními činidly, čímž se označí protilátky - immunoassay test pak zobrazí „čárový kód“ protilátek •identifikuje podmnožinu protilátek, které jsou unikátní pro každého jedince fingerprint vejce Prenatální diagnostika •neinvazivní postupy •UZ vyšetření •biochemický screening • •invazivní postupy •CVS - odběr choriových klků - po 10.t.g. •AMC - odběr plodové vody •časná AMC - 12-14.t.g. •klasická AMC 15-18.t.g. •pozdní AMC •kordocenteza - odběr fetální krve z pupečníku, kolem 20.t.g. •placentocenteza amniocentéza Preimplantační genetická diagnostika •umožňuje prenatální vyšetření molekulárně genetickými nebo molekulárně cytogenetickými metodikami •nutné postupy asistované reprodukce - IVF •vyšetření 1-2 buněk embrya •FISH - nejčastější aneuploidie •DNA - aneuploidie, •monogenně podmíněná •onemocnění preimplantační dg Určování pohlaví •pomocí PCR se namnoží úseky pro jednotlivé chromozomy typické •genetická metoda určení pohlaví využívající úsek genu SRY o délce 204 bp typický pro chromozom Y a gen DXZ4 o velikosti 91 bp chromozomu X chromozom_x_y Určování pohlaví •genetická metoda určení pohlaví využívající gen pro amelogenin •amelogenin se vyskytuje v pseudoautozomální oblasti gonozomů •tento gen o délce 112 bp má na X chromozomu v části intronu 1 deleci dlouhou 6 bp, takže po elektroforéze jsou u mužského pohlaví zjištěny dva amplifikační produkty o různé délce a u ženského jen jeden, kratší typ Určování otcovství •dříve - analýza genových produktů - polymorfizmů erytrocytárních krevně skupinových antigenů, sérových proteinů, izoenzymových variant a antigenních specificit hlavního histokompatibilitního systému člověka •dnes - možné i přímé vyšetření genotypů ve sporu zúčastněných osob metodami DNA diagnostiky, tedy jejich DNA profilování otcovstvi Určování otcovství •introny genů a mezigenové oblasti - nepřepisují se v bílkoviny a enzymy •vysoký stupeň interindividuální variability •nejvhodnější tzv. délkové polymorfizmy DNA, tj. lokusy, jejichž alely se mezi sebou liší různým počtem opakování určitého základního sekvenčního motivu •minisatelitní sekvence typu VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) a mikrosatelity DNA, čili STR (Short Tandem Repeats) DNAfingerprintfamily Jak na to •simultánní amplifikace několika hypervariabilních úseků DNA, mnohočetnou polymerázovou řetězovou reakcí (multiplex PCR) a automatické odečítání alel jednotlivých lokusů po kapilární elektroforéze v genetickém analyzátoru (různé typy kitů pro simultánní detekci 4 až 13 DNA polymorfizmů) •DNA čipy •detekce produktů PCR prostřednictvím hmotnostní spektrofotometrie (MALDI-TOF) • dna-cipy spektr Identifikace onkogenů •podstata nádorové transformace je genetická •mutace postihují geny signálních drah, kontrolních bodů buněčného cyklu, buněčné diferenciace, apoptózy, reparace DNA… •v průběhu buněčných dělení jedné buňky nastává postupná akumulace několika mutací v uvedených skupinách genů, které resultují v její nádorovou transformaci Mechanizmy aktivace celulárních onkogenů •bodová mutace •zmnožení (amplifikace) genu •delece (ztráta části sekvence DNA) genu •přestavba chromozomu •inzerční mutageneze BCR-ABL-protein-cml HER2/neu •produkt genu HER2/neu je transmembránový receptor s tyrozin kinázovou aktivitou •vlastní gen je lokalizován na dlouhém raménku chromozómu 17 v oblasti q11.2-q12 •amplifikace genu HER2/neu je nalézána u řady nádorových onemocnění. •overexprese proteinu HER2/neu je důležitým prognostickým a prediktivním faktorem invazivního karcinomu mléčné žlázy Jaká metoda? •vyšetření amplifikace HER2/neu za použití FISH s přímo značenými sondami HER2/neu (červená) a CEP17 (zelená) •HER2/neu je amplifikován, jestliže poměr mezi počty HER2/neu a CEP17 je > 2 •Video her2neu-1c Identifikace patogenů molekulárně biologickými metodami •kvalitativní i kvalitativní průkaz virové nebo bakteriální nukleové kyseliny ve vzorku •velký význam pro sledování rozvoje virové infekce nebo odpovědi na léčbu antivirotiky (např. u infekcí HIV, hepatitidy B a C, CMV infekce) •detekce úseku genomu zodpovědného za přenos rezistence •možnost přesně určit sekvence jednotlivých bází, identifikovat genotypy viru nebo bakterie, prokazovat mutace. patogen Využití molekulárně biologických metod •u imunosuprimovaných pacientů po transplantaci orgánů •u pacientů s infekční endokarditidou •u pacientů s infekčními komplikacemi po velkých chirurgických výkonech • •detekce a identifikace virů, které není možné běžně izolovat na buněčných kulturách nebo prokazovat jejich antigeny v infikovaných buňkách (např. viry hepatitid C a G, lidské papilomaviry, parvovirus B19) •detekce DNA herpetického viru z likvoru u herpetických infekcí CNS nebo DNA CMV u imunosuprimovaných pacientů po transplantaci orgánů • Evoluční genetika •analýza sekvencí DNA má výhody oproti tradičním metodám studia evoluce (srovnávací anatomie, fyziologie a embryologie) - sekvence DNA a proteinu sleduje jednoduchá pravidla dědičnosti •molekulárně sekvenční data umožňují porovnat evoluční vztahy mezi vzdálenými organismy (shrnuty v diagramech – fylogenetické stromy) Pravidla konstrukce fylogenetických stromů ze sekvencí DNA •seřazení sekvencí, které umožňují jejich srovnání •zjištění rozsahu podobnosti nebo rozdílnosti mezi každými 2 sekvencemi •seskupování sekvencí na základě podobnosti •umístění sekvencí do vrcholu stromu • tree No a teď hurá do laboratoří! J dr Izolace nukleových kyselin (NK) Mgr. Veronika Tanhäuserová • •DNA byla poprvé vyizlována v roce 1869 Friedrichem Miescherem z jader buňek hnisu • •získat DNA/RNA v nativním stavu, v dostatečné čistotě a množství • •výběr metody purifikace závisí na způsobu její následné analýzy • • • DNA,%20RNA-srovnani fm-6 Friedrich Miescher Materiál pro izolaci NK •jednotlivé buňky –prokaryotické organizmy –kvasinky •virové částice •tkáně a orgány eukaryot –mechanická a/nebo enzymatická homogenizace – •materiál používaný k izolaci NK u člověka –leukocyty periferní krve –buňky bukální sliznice –amniové buňky –choriové klky –buňky vlasových kořínků –spermie –epiteliální buňky pokožky –uvolněné buňky v tělních sekretech –aj. • • Dna_Flocked_Swabs Typy metod izolace NK •metody využívající rozdílnou rozpustnost biologického materiálu –fenol-chloroformová extrakce –ethanolová (isopropanolová)precipitace •adsorpce na pevný podklad –vazba NK na křemičité sklo v přítomnosti chaotropních solí (NaI, guanidin thiokyanát, guanidin hydrochlorid) •ultracentrifugace v hustotním gradientu –gradient CsCl • • • • • • Izolace DNA v naší laboratoři •sliny •periferní krev –odběr do chelatačního roztoku (EDTA) •zabránění srážení krve a degradaci DNA DNázami –1-5 dní při teplotě 4°C –dlouhodobě v zamraženém stavu – •lýza buněk •odstranění membránových lipidů –detergenty •odstranění proteinů –proteináza K –fenol-chloroformová extrakce •směs fenol-chloroform denaturuje proteiny a rozpouští lipidy •po centrifugaci –ve spodní organické fázi - směs fenol-chloroformu, proteinů a tuků –v horní vodné fázi - rozpuštěná DNA (molekula DNA je díky vysoce nabité fosfátové kostře polární a tudiž rozpustná ve vodě) •vysrážení DNA –isopropanolová precipitace za přítomnosti kladně nabitých iontů •kladně nabité ionty neutralizují negativně nabité fosfáty DNA •odstranění zbytků solí –70% ethanol •vysušení •rozpuštění v slabě alkalickém pufru phenol-ext1.gif Izolace RNA •náročnější, vyžaduje přísnější podmínky –molekuly RNA jsou mnohem méně stabilní než molekuly DNA –voda upravená inhibitory RNáz, homogenizace tkáně za přítomnosti antioxidačních látek,... – •mRNA tvoří pouze malý podíl celkové RNA –tradiční metody izolace NK a následná separace na mRNA, rRNA a tRNA –metody využívající afinitu poly(A) konce mRNA a oligo(dT) sondy značené biotinem •imobilizace hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA na nosiči (strepavidinem pokryté magnetické kuličky) a odmytí nežádoucích molekul Detekce a kvantifikace NK –spektrofotometrická metoda •pro měření dostatečně čistých vzorků •odhad koncentrace měřením absorbance –NK absorbují UV záření s maximem absorbance při vlnové délce 260nm –A260 = 1,0 odpovídá asi 50 µg/ml DNA nebo 40 µg/ml RNA – •stupeň čistoty NK se stanovuje z poměru A260/A280 –proteiny absorbují UV záření s maximem absorbance při vlnové délce 280nm –A260/A280 = 1,8 čistá DNA –A260/A280 = 2,0 čistá RNA –A260/A280 < 1,75 kontaminace bílkovinami • –fluorescenční metoda •pro měření vzorků s nízkou koncentrací či znečištěných •interkalace etidiumbromidu mezi báze NK, detekce fluorescence po ozáření UV světlem a srovnání s intenzitou fluorescence standardu o známé koncentraci – • Real time PCR Mgr. Marián Hlavna •DNA • - genotypizácia (kvantifikácia alel) • - genotypizovanie (SNP) • - určovanie druhov, SNP, kvantifikácia (HRM) • •RNA • - kvantifikácia transkriptu • • •Taqman sondy •Interkalačná fluorescenčná farbička (SybrGreen) Real time PCR princíp Taqman sond TaqMan GX cartoon Real time PCR – kvantifikácia DNA, RNA fvl580494 Real time PCR genotypizácia SNP TaqMan GX cartoon Real time PCR (HRM) 500px-DNA_melting_scematic_curve_2 SEKVENACE Mgr. Jolana Lipková • Uvědom si Jimmy, že nám na to stačila svářečka a kus drátu Historie-Watson a Crick 1953 Využití • •Diagnostika chorob a časné zjištění náchylnosti jedince k určitým nemocem (rakovina, kariovaskulární onemocnění), genová terapie •Celogenomové sekvenování (evoluční biologie) •Fylogenetika (evoluční vývoj) organizmů •Antropologie: srovnávání DNA k zjišťování migrací lidských ras (zejména podle mitochondriální DNA a Y-chromozomální DNA) •Forenzní vědy: důkaz viny či neviny v zločinu, určení otcovství a podobně – mikrosatelity (test paternity) •Zemědělství: geneticky modifikované plodiny Využití • •Chemická – štěpení zkoumané molekuly v místě modifikace • •Enzymatická – amplifikace krátkých fragmentů očekávané délky Dvě principiálně odlišné metody •Postup: •1. Příprava značené jednořetězcové DNA, jejíž sekvence má být stanovena •2. Rozdělení vzorku DNA do 4 částí •3. Chemická modifikace jednoho nebo bazí v náhodných místech •4. Štěpení molekuly DNA v místech, kde došlo k modifikaci bazí •5. Elektroforéza fragmentů DNA 6. Autoradiografická (nebo jiná) detekce fragmentů DNA • Chemická metoda- Maxam-Gilbert • • »Reakční směs: •DNA templát •primer •ddNTP-fluorescenčně značen •dNTP (100x více než ddNTP) •Taq DNA polymeráza •Pufr • •Soubor ssDNA s fluorescenčně definovaným koncem lišících se o jednu bázi •Rozdělení elektroforézou •Vyhodnocení • Enzymatická metoda -Sanger • ì H sequencing http://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html 165877-29144-marvin-the-martian_large gel band band4 band band2 band3 band4 band4 band3 band band band2 band2 Sekvenácia II. band4 band band2 band3 A T G C G A G C A T A C T A G T Automatické sekvenování Vyhodnocení Buněčné kultury Mgr. Katarína Kuricová Buněčná kultura je systém, kde jsou in vitro kultivované buňky prokaryotické, eukaryotické či rostlinné za zvláštních specifických podmínek. Většina buněčných linií má omezenou životnost (stárnutí, zástava dělení). Jen některé kultury jsou nesmrtelné = permanentní linie (nádorové, imortalizované). Buňky podle způsobu kultivace: a) adherentní (rostou přichycené k podkladu) b) suspenzní (volně se vznášejí v médiu) Není známa metoda kultivace buněk jater, nervů a ledvin, epitely tvoří jednovrstevné kolonie, fibroblasty můžou tvořit až 3 vrstevné. Red_White_Blood_cells Práce s buněčnými kulturami ... spočívá v zajištění optimálních podmínek pro přežívaní a růst kultivovaných buněk. - Obecně má práce s buněčnou kulturou tři fáze: 1. izolace buněčného kmene 2. udržování buněčné linie a její expanze 3. využití namnožených buněk v pokusu Potřeba regulace fyzikálních, chemických a biologických faktorů: - teplota (optimální pro organismus původu) - média (ionty, pH, osmolarita, sacharidy) - sérum - kontaminace (antibiotika + monitoring) img1216 Cell_Culture_Dish