Restrikční analýza

Petra Linhartová


Restrikční analýza je molekulárně biologická metoda, která je využívána při DNA diagnostice.


Princip: Metoda je založena na principu polymerázové řetězové reakce, kdy je amplifikována cílová
sekvence, která je v následné reakci štěpena pomocí bakteriálních endonukleas („restriktas“).
Restrikční endonukleasy (RE) jsou enzymy, které se vyvinuly během evoluce u bakterií k štěpení cizí
DNA. RE dokáží štěpit DNA, pokud obsahuje určitou přesně definovanou sekvenci nukleotidů. Názvy RE
jsou odvozeny od jejich původce - např. EcoRI od E. coli, kdy RE rozpoznává specifickou oblast
GAATTC (jedná se často o palindromatickou sekvenci).


                                   5´-CCT  GßAATTC AGG-3´

                                    3´-GGA CTTAAÝG TCC-5´


Šipky naznačují místo štěpení DNA. Štěpeny jsou vnitřní fosfodiesterové vazby. Při detekci SNP
(Single Nucleotide Polymorphism = jednonukleotidový polymorfismus) je RE enzym volen tak, aby
štěpil DNA právě v místě tohoto polymorfismu. RE mají     specifickou teplotu, při které štěpení
probíhá optimálně. Restrikční fragmenty jsou poté elektroforeticky separovány.



Příklad: Máte vybraný gen, ve kterém se vyskytuje SNP (záměna A a C v pozici 100). Když jste po
amplifikaci PCR získal fragment o velikosti 350bp a produkt necháte restrikčně štěpit pomocí EcoRI,
tak v případě, že vzorek je:

-         homozygot C/C, získáte pouze jeden band na gelu o velikosti 350bp (protože RE nerozpoznal
místo štěpení),

-         homozygot A/A , získáte dva proužky na gelu o velikosti 100 a 250bp (protože RE rozpoznal
místo štěpení),

-         heterozygot A/C, získáte 3 proužky na gelu o velikosti 100, 250 a 350bp (protože RE
rozpoznal místo štěpení na jedné z alel).