Předmět: Genetika v zubním lékařství – cvičení (jaro 2011) Jméno a příjmení: Studijní skupina: Datum: Úvod: Interleukin 1 (IL-1) IL-1 je protein ze skupiny cytokinů. Je uvolňován monocyty, makrofágy a dendritickými buňkami. V organismu se vyskytuje ve dvou formách, IL-1alfa a IL-1beta. Hladiny IL-1α a IL-1β (prozánětlivé cytokiny) a poměr IL-1 s antagonistou IL-1 receptoru (IL-1RA, protizánětlivý cytokin) jsou zvýšené u chorob parodontálních tkání. IL-1 se nachází na chromozomu 2q13-q21. Recesivní alely IL1A -889 a IL1B +3953 zvyšují genovou transkripci a produkci proteinů, čímž roste prozánětlivá odpověď. Zatímco recesivní alely IL1RN VNTR snižují genovou transkripci a produkci proteinů. Existují již asociační studie u parodontitidy, na trhu jsou komerčně dostupné kity. Cíl: IL-1RA 1. Izolace DNA z periferní krve 2. Polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction = PCR) 3. Elektroforéza v agarózovém gelu Metodika: ad1. Izolace DNA z periferní krve Princip: Fenol-chloroformovou extrakci publikovali v roce 1987 Chomczynski a Sacchi. DNA (deoxyribonukleová kyselina) může být z krve izolována pomocí chloroformové extrakce, kdy dochází k rozdělení buněčných kompartmentů (DNA, RNA a proteinů) mezi 2 fáze na základě jejich hydrofilních, resp. hydrofobních vlastností. Denaturované proteiny tvoří prstenec mezi oběma fázemi. Vodná fáze je poté odebrána a přidáním isopropanolu dojde ke sražení nukleové kyseliny. ad2. PCR IL-1R VNTR Princip: Kary B. Mullis dostal v roce 1983 Nobelovu cenu za objev PCR. PCR je enzymatická reakce probíhající v teplotních cyklech, při které dochází na principu komplementarity bazí k amplifikaci (zmnožení) zvolených úseků DNA. Tyto úseky musí být ohraničeny na začátku a na konci primery (krátkými oligonukleotidy DNA). Výsledkem PCR je 10^n (n = počet cyklů reakce) množství kopií původní sekvence DNA. VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) označuje variabilní počet tandemových opakování, neboli polymorfní úsek DNA (lokus), který je vytvořen tandemovým uspořádáním mnohočetných kopií krátkých sekvencí DNA. Lokus má v populaci několik alel. Postup: Délka produktu: 86bp Primery: P1 IL-1Rf CTC AGC AAC ACT CCT AT (Ta = 50,0°C…56,3°C) P2 IL-1Rr TCC TGG TCT GCA GGT AA (Ta = 51,1°C…55,8°C) Reakční směs pro PCR 25,0µl: Master Mix (MM) roztok Množství v µl na 1 vzorek Množství v µl na vzorků PCR voda 12,5 Pufr DYNEX 2,5 MgCl[2] (25mM) 4,0 P1 1,25 P2 1,25 dNTP 0,5 Taq polymerasa (1Uµl^-1) 1,0 23,0µl MM + 2,0µl templátové DNA (50ngµl^-1) + 1 kapka minerálního oleje na 1 vzorek Vzorky: MIG Průběh PCR v termocycleru: 1. 95°C 5 minuty 2. 95°C 45 sekund krok 2.- 4. – cyklus 35x 3. 56°C 45 sekund 4. 72°C 45 sekund 5. 72°C 7 minut 6. 10°C 10 minut ad3. Elektroforéza v agarózovém gelu Princip: Působením elektrického napětí dochází k pohybu molekul DNA od katody k anodě. V závislosti na hustotě prostředí jsou molekuly separovány dle velikosti, případně i jiných parametrů (konformace). K vizualizaci se nejčastěji používá interkalační barvivo ethidiumbromid (EtBr), které se vmezeřuje mezi baze v dsDNA, a po ozáření UV světlem fluoreskuje. Postup: Příprava gelu: 3,0 % gel agarosa Serva a 1x koncentrovaný TBE pufr Přivést k varu v mikrovlnné troubě. 1,0µl EtBr (c = 5µg µl^-1) na 10,0ml gelu Nanesení vzorků a standardu na gel: 20,0µl PCR produkt 2,0µl Loading buffer 4,0µl velikostní standard Gene Ruler Fermentas 50bp Průběh elektroforézy: Při konstantním napětí 90V po dobu 30 minut. Výsledky: Homozygot/heterozygot Délky produktů v bp A. 4 repetice 412 B. 2 repetice 240 C. 3 repetice 326 D. 5 repetic 498 E. 6 repetic 584 Gel a hodnocení: 240bp B 326bp C 412bp A 498bp D 584bp E genotypy st A/A A/D A/B A/B B/B B/B B/D A/A DOPLŇTE! Závěr: