Mikrobiologie a imunologie Ondřej Zahradníček Kostka Abych se představil lMUDr. Ondřej Zahradníček lpovolání: klinický mikrobiolog, asistent na LF MU; učíme u nás bakalářské obory, mediky, zubaře i studenty přírodovědecké fakulty lbudu vám přednášet, ale nebudu vás zkoušet, to budou kolegové a kolegyně z našeho ústavu lzájemci se u mne mohou přihlásit a mohou se přijít podívat přímo k nám Jak se učit na zkoušku lVe dvanácti hodinách nelze probrat totéž, na co mají studenti denní formy hodin třicet. Přesto probereme všechna témata, jen je více či méně zkrátíme lVíce zkrátíme ta témata, která jsou spíše „na naučení“, méně ta, která jsou spíše „na pochopení“. lNa IS MU ve Studijních materiálech najdete nezkrácené verze prezentací lNajdete tam také skripta ke stažení. To vše bude dostupné v průběhu semestru. Přehled probíraných témat lSezení 1 – 9. března 2012/I –1 základní pojmy, patogenita a virulence –2 přehled vyšetřovacích metod lSezení 2 – 9. března 2012/II –3 dekontaminační metody –5 základy imunologie lSezení 3 – 6. dubna 2012 –6 respirační infekce –7 trávicí infekce –8 močové infekce Přehled probíraných témat lSezení 4 – 4. května 2012 –9 STD, infekce kůže a oka –11 infekce krevního řečiště a systémové infekce –12 hnisavé infekce a infekce měkkých tkání lSezení 5 – 4. června 2012 –4 antimikrobiální látky –10 nozokomiální nákazy lSezení 6 – 5. června 2011 –13 odběry vzorků –14 mykologie a parazitologie Přehled mikrobů. Patogenita a virulence Mikrobiologie a imunologie – BDKM021, BAKM021 Téma 1 Ondřej Zahradníček Kostka Náš ústav Provoz (analýza klinických vzorků) Výuka Výzkum Obrázek1 PC210117 Foto: vše Archiv MU Obrázek22 Klinická mikrobiologie a imunologie lKlinická mikrobiologie se jako samostatný obor odštěpila začátkem 20. století z patologie. Do té doby se diagnostikou mikrobiálních původců ve vzorcích pacientů zabývali patologové lO více než půlstoletí později se z mikrobiologie vyčlenila imunologie, tedy věda o obranyschopnosti organismu. Dnes už existují samostatné imunologické ústavy a laboratoře, medici mají samostatnou zkoušku z imunologie. Klinická imunologie je však zároveň i součástí interny, případně pediatrie. Co nás čeká v tomto předmětu lPovídání o klinicky významných mikrobech a jejich vlastnostech lPovídání o určování mikrobů a vůbec o práci v laboratoři klinické mikrobiologie lKrátké představení lidské imunity a imunologie jako takové lA hlavně představení infekcí jednotlivých orgánových soustav, způsobů odběru vzorků, interpretace výsledků a podobně 74 virus-ebola-Filoviridae Ebola http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm Co je to mikrob lMusí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické lMusí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá lZ druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická. 35 10 Bakterie Helicobacter a kolem ní schematicky její genom http://biology.plosjournals.org/archive/1545-7885/3/1/figure/10.1371_journal.pbio.0030040.g001-M.jp g Co jsou všechno mikroby lMikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea (dříve archeobaktérie), různé organismy schopné vydržet hluboko pod mořem nebo v extrémních podmínkách horkých pramenů lJako klinického mikrobiologa mne tyto mikroby neživí, přesto musím uvést, že jsou zajímavé a úžasné Třídění živých organismů lPriony – neobsahují DNA, většinou se vůbec nepovažují za živé organismy lViry a bakteriofágy lBuněčné organismy –Archea (archeobakterie) –Eubacteria (eubakterie) –Eucarya (eukaryotní organismy) ljednobuněčné lmnohobuněčné Klinicky významné mikroby lKlinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo (ne tedy pro člověka = tvůrce, ale pro člověka = objekt) l„Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo dokonce pomáhají lKaždý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. Dokonce i mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy). 20 10 Neisseria gonorrhoeae http://medicine.plosjournals.org/archive/1549-1676/2/1/figure/10.1371_journal.pmed.0020024.g001-M.j pg Hlavní klinicky významné mikroby lViry (a priony) lBakterie (třeba streptokok nebo Escherichia) lHouby (kvasinky a plísně) lParaziti – přesahují pojem mikrob: –Vnitřní paraziti lPrvoci (třeba původce malárie) lMotolice (třeba motolice jaterní) lHlístice (třeba roup nebo škrkavka) lTasemnice (třeba tasemnice dlouhočlenná) –Vnější paraziti (vši, blechy, štěnice) Co nás zajímá o mikrobech morfologie jaký mají tvar a uspořádání struktura z čeho se skládají fyziologie jak se chovají metabolismus jak a čím se živí odolnost jak vzdorují výkyvům klasifikace jak jsou vzájemně příbuzné Co nás zajímá o klinicky významných mikrobech patogenita které orgány osidlují a jak patogeneze jakým způsobem případně škodí přenos jak se přenášejí inkubační doba jak dlouho trvá, než se projeví diagnostika jak je můžeme poznat léčba a prevence co proti nim můžeme dělat Morfologie klinicky významných mikroorganismů lViry se skládají z DNA nebo RNA a bílkovin; některé viry mají navíc membránový obal, který „ukradly“ nějaké hostitelské buňce lViry mají kubickou nebo šroubovicovou symetrii. Některé mají třeba tvar dvanáctistěnu. Mohou tvořit „pseudokrystaly“ lKvasinky mají tvar vajíčka, mohou pučet a tvořit tzv. pseudomycelia. Na povrchu mají buněčnou stěnu lVláknité houby a paraziti jsou tvarově velice rozmanití, navíc se liší vývojová stádia 28 rhinovirus-icosaedre01 Virus běžné rýmy http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm Morfologie bakterií lKoky ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích (neříkejme raději „streptokoky“ a „stafylokoky“, bylo by to matoucí) lTyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé, tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté a i tyčinky můžou být různě uspořádané lSpirochety – tenké spirálovité bakterie lBeztvaré bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, takže nemají tvar) 06 ECFS Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.) http://www.morgenwelt.de/typo3temp/5ce14d39b5.jpg Zprohýbaná tyčinka – helikobakter 39 helicobacter%20pylori http://vietsciences.free.fr/nobel/medecine/images/helicobacter%2520pylori.JPG Spirochety 11 treponema 53 kansen_02 idsc.nih.go.jp/.../k03/k03_012/k03_012.html www.primer.ru/std/gallery_std/treponema.htm Typ buněčné stěny lGrampozitivní bakterie mají tlustou a jednoduchou buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně mechanicky. Při barvení podle Grama jsou fialové. Například stafylokoky. lGramnegativní bakterie mají tenkou, ale o to složitější buněčnou stěnu. Jsou odolné hlavně chemicky. Při barvení podle Grama jsou červené. Například escherichie. lGramem se nebarvící bakterie buněčnou stěnu nemají (mykoplasmata) nebo ji mají hodně jinou (mykobakteria). Grampozitivní gm+%20cell%20wall Gramnegativní gm-%20cell%20wall mixed%20gram G+ G– http://www.arches.uga.edu/~emilyd/mibo3510/gm-%2520cell%2520wall.jpg Fimbrie a bičíky lMnohé bakterie jsou schopny pohybu lK pohybu slouží hlavně bičíky lFimbrie mohou vedle pohybu sloužit např. i k přilnutí bakterie na povrch nebo při výměně genetické informace lBičíky bakterií jsou úplně jiné než bičíky eukaryotních organismů Bakterie s bičíky (Escherichia coli) 03 escherichia_coli_1 http://www.biotox.cz/toxikon/bakterie/bakterie/obr/escherichia_coli_1.htm Pouzdro a biofilm lPouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání lBiofilm je souvislá vrstva, vzniklá z.bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě lPřímý kontakt plovoucích bakterií s povrchem lPřilnutí na tento povrch lRůst a shlukování těchto bakterií do mikrokolonií lProdukce polymerové matrix lVytvoření trojrozměrné struktury, které se říká biofilm lBakterie regulují svůj počet pomocí takzvaného quorum sensingu l(Podle kolegyně Černohorské z našeho ústavu) Jak se tvoří biofilm bakterií + Neobarvené pouzdro lV barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší; mikroskopista pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo 05 Burri http://pathmicro.med.sc.edu/fox/capsule.jpg Sporulace lSporulace je něco jako zimní spánek, ale mnohem dokonalejší než je zimní spánek zvířat. Opakem spory je vegetativní forma života buňky lSpory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně lSpora vzniká tak, že se buňka rozdělí na dvě části. Ty se však neoddělí úplně: jedna, ze které se stane spora, je obklopena tou druhou, které zůstává vegetativní forma. Takové spoře říkáme endospora lV extrémních podmínkách vegetativní buňka hyne a zůstane pouze spora lZa příznivých podmínek spora vyklíčí lNepleťme si spory bakterií a spory hub! Spory různých druhů rodu Bacillus 22 Genre%20Bacillus aa http://membres.lycos.fr/neb5000/BacteriologieI/Groupes%20Bacteriens/Batonnets%20et%20coque%20Gram-p ositifs%20formant%20des%20endospores.htm 21 bacillus Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví při téměř žádném barvení www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Bugs/index.shtml Fyziologie a metabolismus bakterií lTak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus lKatabolismus může být trojí: –Fermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík. Využívají ji například střevní bakterie –Aerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík. Využívají ji bakterie, které nacházíme ve vnějším prostředí, na rostlinách aj. –Anaerobní respirace – jiný akceptor elektronů než kyslík, pro člověka málo významné Množení bakterií lKaždá bakterie má svou generační dobu lZa jednu generační dobu jsou z jedné dvě, za desetinásobek je z jedné bakterie 1024 bakterií (teoreticky) a podobně lIdeální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali odpadní produkty lPozor, nepleťte si generační dobu (za jak dlouho se bakterie rozdělí na dvě) a kultivační dobu (za jak dlouho vidíme výsledek na kultivační půdě) Životní podmínky bakterií lPro život bakterií jsou nutné určité podmínky lTyto podmínky musíme splnit také v případě, že chceme bakterie uměle pěstovat (třeba proto, abychom je přitom mohli určovat) lNestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit lNa druhou stranu, pokud s bakteriemi bojujeme (při desinfekci, sterilizaci), nestačí obvykle potlačit jejich množení, ale musíme je úplně zahubit. Životní podmínky – pokračování lPodmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí lNepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Osa působícího faktoru Takto působí na bakterie např. různé pH (za předpokladu, že se nemění ostatní podmínky) Interakce mikrob – makroorganismus: obecně (1) lMezi mikrobem (mikroorganismem) a hostitelským organismem (člověk, ale i zvíře, rostlina, jiný mikrob…) může nastat celá škála vztahů – interakcí. Může to být kooperace (člověk poskytuje útočiště střevním escherichiím a ty se mu za to odvděčí tvorbou vitamínů), indiferentní vztah nebo přímo antagonistický vztah. Interakce mikrob – makroorganismus: obecně (2) lZ hlediska klinické mikrobiologie je významný vztah mikroorganismus – makroorganismus (což může být člověk, ale také zvíře či rostlina) lMůže jít o symbiózu, neutrální vztah či antibiózu lČasto se používají i termíny z potravních řetězců (komenzalismus, saprofytismus, parazitismus). Virulentní mikroby jsou zpravidla – ale ne vždy – parazitické lNe vždycky se dají mikroby jednoduše „zaškatulkovat“. Často záleží na okolnostech, jestli bude mikrob „zlý“ nebo „hodný“ Interakce mikrob – makroorganismus: mikroby napadající člověka lMikroorganismy, které napadají člověka, jsou vybaveny různými faktory virulence – jsou to faktory, které zajišťují schopnost mikroba proniknout do organismu. Nejčastěji to bývají různé enzymy, toxiny, bakteriální pouzdro aj. lMakroorganismus se mikrobům brání řadou různých způsobů. Jde vždy o to, zda se více prosadí faktor virulence mikroba, nebo mechanismus obranyschopnosti makroorganismu Patogenita mikroorganismů lExistují mikroby nepatogenní – neschopné vyvolat nemoc. Většinou jsou to ty, které vůbec nejsou schopny do organismu proniknout. lExistují mikroby podmíněně patogenní, které vyvolávají nemoci jen za určitých podmínek. Často jsou to prospěšné bakterie, které jsou většinou „hodné“ a jen výjimečně začnou „zlobit“, když se třeba dostanou kam nemají, nebo když zmutují lExistují i mikroby obligátně patogenní, které vyvolávají nemoc vždy, když se dostanou do těla v dostatečném počtu a vhodným způsobem Předpoklady patogenity l1) Přenosnost z hostitele (zdroje) na další organismus (osobu) l2) Nakažlivost – schopnost narušit obranu hostitele l3) Virulence – schopnost mikroba nějak poškodit hostitele. lFaktory zodpovědné za virulenci, respektive patogenitu –Kolonizace hostitele – fimbrie, bičíky, adheziny –Faktory invazivity – vnikání do tkáně –Toxiny (jedy), hlavně u bakterií: neurotoxiny, enterotoxiny, lokální toxiny a jiné –Faktory boje s obrannými mechanismy hostitele –Biofilm – složitý útvar, složený nejen z mikrobů Patogenita a virulence lVirulence –okamžitá vlastnost konkrétního kmene mikroba (kmen = populace z jedné buňky) –Kmeny tedy mohou být –avirulentní – tedy v daném okamžiku úplně neškodné, neschopné napadat makroorganismus –méně či více virulentní – tedy disponující různou mírou schopnosti napadnout makroorganismus. lPatogenita –vlastnost určitého mikrobiálního druhu –Nepatogenní: nejsou schopny vyvolat u daného živočišného druhu nemoc (všechny jejich kmeny jsou avirulentní) –Potenciální (oportunní) patogeni: vyvolávají chorobu jen za určitých okolností („zvrhnou“ se, dostanou se jinam) –Obligátní (primární) patogeni vyvolávají nemoc "vždy" Příklad působení patogenního mikroba Necrotizing fasciitis Hodné mikroby: běžná mikroflóra lMnoho mikrobů nám pomáhá. Tím, že osidlují naše sliznice, zabrání tomu, aby je osídlily zlé patogenní mikroby. Některé pomáhají i jinak lNejvíc, asi kilogram, je jich v tlustém střevě lHodně mikrobů je i v dutině ústní a v hltanu lU žen je mikrobní ekosystém v pochvě lI přes relativní nedostatek vody má svoji mikroflóru také kůže (poněkud se liší na různých místech) 28 proteus1 Plazivá bakterie Proteus se podílí na likvidaci nestrávených bílkovinných zbytků potravy http://faculty.smu.edu/ayati/proteus/proteus1.gif Mikroflóra jako ekosystém lKdysi lidé mysleli, že všechny škůdce úrody jednoduše zahubí například DDT. Ukázalo se ale, že takový brutální zásah často nadělá víc škody než užitku, zvlášť když se použije nevhodným způsobem lPodobně složitý ekosystém je i třeba střevní mikroflóra. I proto dnes na střevní infekce většinou nedoporučujeme antibiotika, protože systém „rozhodí“ často ještě víc. Co ovlivňuje infekci lVstupní brána infekce (kudy mikrob pronikl) lForma infekce –podle rozsahu – lokální / celková –podle vyjádření průběhu – bezpříznaková / příznaková –u infekce s příznaky dále průběh abortivní – typický – komplikovaný lVylučování mikrobů z těla lV podstatě je plynulý přechod mezi infekcí, bezpříznakovou kolonizací a běžnou flórou. Co ovlivňuje formu infekce lna straně mikroba: vybavenost faktory virulence (může být dána třeba i tím, že mikrob sám je napaden bakteriálním virem – bakteriofágem) lna straně makroorganismu: stav imunity, stav anatomických bariér, hormonální rovnováha, případné základní onemocnění a spousta dalších věcí lforma vzájemného setkání mikroba a makroorganismu Přehled mikrobiologických vyšetřovacích metod Mikrobiologie a imunologie – BDKM021, BAKM021 Téma 2 Ondřej Zahradníček Obdélníky a kulaté obdélníky Cíle mikrobiologické diagnostiky lOdhalení původce nemoci (patogena) – pokud možno se snažíme najít opravdového původce, ne nějakého mikroba, který se v daném místě mohl třeba objevit jen náhodou; ne vždycky je ale role mikroba v daném infekčním procesu jasná lNěkdy: zjištění citlivosti patogena na antimikrobiální látky (bakterie a kvasinky) lNěkdy také: určení faktorů virulence Co je to vzorek lVzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře: lkusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) lstěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. lPři diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. Co je to kmen lKmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba, je to směs buněk, které pocházejí z jedné buňky a mají všechny stejné vlastnosti lKmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. lKochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. Přehled metod lMetody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt –Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem –Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu lMetody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů Co vidíme v mikroskopu lV případě mikroskopování kmene vidíme jeden typ mikrobiálních buněk lV případě mikroskopování vzorku můžeme vidět –mikroby – nemusí tam být žádné, a může tam být i klidně deset druhů –buňky makroorganismu – nejčastěji epitelie a leukocyty, někdy erytrocyty –jiné struktury, např. fibrinová vlákna, buněčnou drť (detritus) a podobně Typy mikroskopie lElektronová mikroskopie – u virů; spíše výzkum než při běžném průkazu virů lOptická mikroskopie –Nativní preparát – na velké a/nebo pohyblivé mikroby –Nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety) –Fixované a barvené preparáty, například: lBarvení dle Grama – nejdůležitější bakteriologické lBarvení dle Ziehl-Neelsena – např. u bacilů TBC lBarvení dle Giemsy – na některé prvoky Gramovo barvení - princip lGrampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem se neodbarví ani alkoholem. Gramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem. Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se Obarví se Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se na červeno Dift1 P1010003 Mikroskopie vzorku Mikroskopie kmene Foto: archiv MÚ Kultivace (pěstování) bakterií (případně také kvasinek) lBakterie často pěstujeme na umělých půdách lBakterie na půdu naočkujeme a poté půdu umístíme do termostatu, většinou nastaveného na 37 °C (pro bakterie významné pro člověka je to většinou optimální teplota – což má logiku) lZa 24 (někdy až 48 nebo ještě víc) hodin půdu vytáhneme a pozorujeme, jak nám bakterie vyrostly lVláknité houby se pěstují mnohem déle lViry a paraziti se většinou vůbec nepěstují Kultivace bakterií – podmínky lBakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod. lNěkteré jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy lPoužíváme různá kultivační média, sloužící k.určitým účelům lAerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry lStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku. Kapnofilní zase zvýšený podíl CO2. lPřipravené kultivační půdy se uchovávají v chladničce P1010008 Foto: archiv MÚ Smysl kultivace bakterií lProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? –Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) –Abychom získali kmen – pouze pevné půdy –Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k.identifikaci Pojem kolonie lKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) lKolonie je vždy tvořena jedním kmenem. lV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) lPopis kolonií má významné místo v.diagnostice S3 Foto: archiv MÚ Kultivace v praxi lVzorek se vloží do tekuté půdy nebo nanese na pevnou půdu lU pevné půdy se ho snažíme tzv. mikrobiologickou kličkou rozředit, abychom získali jednotlivé kolonie a mohli dále pracovat s.kmeny mikrobů lTekuté půdy –jsou půdy pomnožovací –základem je zpravidla hovězí vývar a bílkovinný hydrolyzát –nejdůležitější je peptonová voda, bujón, VL-bujón, selenitový bujón (selektivně pomnožovací) Tekuté půdy P1010001 Foto: archiv MÚ Hemofil na ČA Pevné (agarové) půdy lAbychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. •Základem je opět masopeptonový bujón, ale navíc obsahují výtažek z agarové řasy. Používala se i želatina, ale neosvědčila se tolik jako agar. Foto: www.medmicro.info V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Rozočkování 1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až na konci izolované kolonie Kult5 Pevné půdy Foto: archiv MÚ Existují různé typy pevných půd lDiagnostické půdy – roste "kdeco, ale různě" (krevní agar, VL krevní agar) –Chromogenní půdy – zvláštní druh diagn. půd lSelektivní půdy – roste "jen málo co" (krevní agar s.10 % NaCl pro kultivaci stafylokoků) lSelektivně diagnostické půdy – např. Endova (jen G–, a rozlišení bakterií podle štěpení laktózy) lObohacené půdy – k pěstování náročných baktérií (čokoládový agar, což je zahřátý krevní agar) lSpeciální půdy – mají své zvláštní určení (MH půda pro testy citlivosti kmene k antibiotikům) Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae3 Anaerobní bakterie nesnášejí kyslík. Musíme je tedy pěstovat ve speciální atmosféře bez kyslíku. Foto: archiv MÚ Foto: archiv MÚ Biochemické identifikační metody lI mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano lBakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor lExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Možnosti praktického provedení lRychlé testy (vteřiny až minuty) –Katalázový test –Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) lTesty s inkubací (hodiny až dny) –Jednoduché zkumavkové testy –Složité zkumavkové testy –Sady jednoduchých zkumavkových testů –Testy v plastové destičce (miniaturizace) –Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test lKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 14 catalase medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm 08 oxidase3 Příklady dalších testů: oxidázový test (diagnostický proužek) medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Provedení testu v praxi Obrázek20 Foto: archiv MÚ 11 indole …a další testy 15 urease2 medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Moderní biochemické testy zahrnují i desítky reakcí lTesty se dělají v důlcích plastových mikrotitračních destiček. lPočet testů v sadách kolísá od sedmi až po více než padesát lLiší se v technických detailech. Vždy je však substrát vysušený, bakterie se nejprve rozmíchá ve fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr Foto: archiv MÚ Zahraniční soupravy 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 Foto: archiv ústavu http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. Pokus na zvířeti lPokus na zvířeti býval důležitou součástí diagnostiky v začátcích mikrobiologie. Jsou ale výjimečné případy, kdy se uplatní i dnes. newzealand7 www.rockinjawrabbits.com/newzealand.htm Průkaz nukleové kyseliny lmetody bez amplifikace nukleové kyseliny (klasické genové sondy) lmetody s amplifikací (namnožením) –PCR (polymerázová řetězová reakce) –LCR (ligázová řetězová reakce) lPrincipiálně se použití v mikrobiologii neliší od použití jinde (např. v genetice) lNevýhoda – někdy jsou až příliš citlivé, takže se prokáže každá molekula DNA, která mohla třeba „přilétnout odněkud zvenčí“. Citlivost se dnes ale dá omezit. Metody založené na interakci antigen – protilátka lO antigenech a protilátkách bude ještě řeč, až se budou probírat základy imunologie. lProzatím si pouze představíme v hrubých rysech mikrobiální antigen a protilátku proti němu, abychom si pak ukázali, jak se jejich vzájemná interakce využívá v diagnostice Co je to protilátka lProtilátka je bílkovina, imunoglobulin, produkt imunitního systému člověka (nebo zvířete). lProtilátka se dá prokázat pomocí specifického antigenu, proti kterému se vytvořila Co je to antigen Antigen je struktura na povrchu mikroba (ale i třeba pylového zrnka či zvířecího chlupu), které tělo provokuje k tvorbě protilátek Antigen se dá prokázat pomocí protilátky, která se proti němu vytvořila například u zvířete Serologické metody (založené na interakci antigen – protilátka) lpracují s reakcí antigen – protilátka (za vzniku komplexu); vzájemně se liší způsobem detekce komplexu antigen – protilátka lpři stejném principu metod se dají využít pro průkaz antigenu (pomocí zvířecí protilátky) i pro průkaz protilátky v těle pacienta (pomocí antigenu mikroba, nebo i celého mikroorganismu) Serologická reakce v praxi TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - www.medmicro.info Protilátku antigenem, nebo antigen protilátkou? Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Průkaz antigenu a antigenní analýza lV rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy: –Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku –Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) lU nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky Serologická laboratoř Obrázek10 Foto: archiv MÚ Čerstvá, nebo dávno prodělaná nákaza? lPo nákaze přetrvávají protilátky dlouhodobě, někdy celoživotně. Samotný nález protilátek tedy tolik neznamená. Pro rozlišení čerstvé × dávno prodělané nákazy se používá: –zjištění množství protilátek (jako tzv. titru) a změna tohoto množství v čase (dynamika titru) –rozlišení protilátek třídy IgM a IgG (jen u některých novějších reakcí je to ovšem možné) –stanovení tzv. avidity (síly vazby protilátek) Průběh protilátkové odpovědi lAkutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM lPacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) lChronická infekce: různé možnosti IgM a IgG 1 1 2 2 Ukázka serologické reakce ELISA ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! Foto: archiv MÚ Nespecifické antigeny a heterofilní protilátky lNespecifický antigen (Paul-Bunnellova reakce): protilátky reagují s nějakým jiným antigenem než s antigenem mikroba lHererofilní protilátky: protilátky nejsou namířeny přímo proti mikrobu, ale proti nějaké molekule, která se při infekci tvoří (kardiolopin u syfilis) Přehled sérologických metod lPrecipitace lAglutinace (a aglutinace na nosičích) lKomplementfixační reakce (KFR) lNeutralizace (ASLO, HIT, VNT) lReakce se značenými složkami: –Imunofluorescence (IMF) –Radioimunoanalýza (RIA) –Enzymová imunoanalýza (EIA, ELISA) –Imunobloty (= zvláštní případ ELISy) Rozdíl mezi staršími a novějšími metodami lStarší metody (aglutinace, komplementfixace, neutralizace) neumějí rozlišit protilátky třídy IgG a IgM. Proto je tu nutno odebírat dva vzorky séra a sledovat dynamiku titru. lNovější metody toto nepotřebují. Titry se nezjišťují, u metody ELISA se zato zjišťují hodnoty absorbance, odpovídající intenzitě reakce (množství molekul, které reagovaly) Práce laboratoře v praxi lDo laboratoře přijde vzorek lK nepřímému průkazu jsou přijímány vzorky séra (kde hledáme protilátky) lK přímému průkazu jsou přijímány vzorky z těch míst na těle, kde předpokládáme infekci: nejčastější jsou výtěry z krku a nosu, vzorky moče a stolice, ale někdy přijde i třeba kousek srdeční chlopně odebraný při operaci Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!! U PACIENTA LABORATOŘ Indikace vyšetření – zda, jaké Vlastní provedení odběru Transport materiálu Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu Zaslání výsledku Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Nashledanou příště… Foto: O. Z. P519_03sput_gnty_u2