CHEMILUMINISCENČNÍ TEST 3055755 •MEM: 1ml zásobního MEMu + 9ml destil. H2O upravit pH – přidat 50µl NaHCO3 •Luminol: 70µl NaHCO3 + 50µl 0,1 M luminolu + 450µl připraveného MEMu •Luminol 2: 60µl luminolu naředěného výše + 250µl připraveného MEMu •Pipetovací schéma: AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl B C D E F G 3055755 AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl MEM 85 µl luminol 10 µl škrob x krev 10 µl MEM 75 µl luminol 10 µl škrob 10 µl krev 10 µl 3055755 FAGOCYTÓZA O.Tichá, FNusA •Fagocytóza je proces pohlcení a degradace částic větších než 0,5 µm. → pohlceným materiálem mohou být cizorodé bakterie, poškozené či odumřelé buňky či jejich části, minerální částečky, atd. 3055755 •FAGOCYTUJÍCÍ BUŇKY neutrofil eosinofil basofil monocyt makrofág dendritická b. 70px-Neutrophil 70px-Eosinophil2 70px-Basophil 70px-Monocyte 70px-Macrophage 70px-Dendritic_cell 3055755 V periferii je cca 7% celkového množství fagocytů, zbytek je v kostní dřeni, odkud se průběžně vyplavují a zároveň doplňují. KREVNÍ DIFERENCIÁL • využití průtokové cytometrie • s mAb nebo bez nich • granulocyty tvoří 40-65% všech leukocytů periferní krve • 3055755 PRŮBĚH FAGOCYTÓZY •ADHEZE („rolling“) → cytometrie – exprese LAD1, LAD2 •EXTRAVAZACE A DIAPEDÉZA •ROZPOZNÁNÍ OPONIZOVANÝCH ČÁSTIC •CHEMOTAXE → test migrace pod agarózou •INGESCE → fagocytóza mikroorganismů nebo inertních částic •DIGESCE - mechanismus nezávislý na kyslíku • → mikrobicidní test, detekce enzymů • - mechanismus závislý na kyslíku • → mikrobicidní test, NBT, INT, detekce myeloperoxidázy, chemiluminiscenční test, „burst“ test 3055755 3055755 3055755 ROZPOZNÁVACÍ MECHANISMY FAGOCYTŮ Fagocyty jsou schopné rozpoznat struktury, které se nacházejí na povrchu mikroorganismů, ale ne na buňkách vlastních. Tyto struktury jsou evolučně konzervované, sdílené různými mikroorganismy a nezbytné pro jejich život. Příklady: • LPS (G-bakterie), peptidoglykany (G+ bakterie), glukany a manany (kvasinky a plísně) • • Opsoniny – komplementové fragmenty (C3b), protilátky (Fc fragment) • • Fosfolipidy - na povrchu vlastních apoptotických buněk (za normálních okolností se nacházejí výhradně na vnitřní straně membrány) 3055755 PRO ROZPOZNÁNÍ RŮZNÉ DRUHY RECEPTORŮ Pro rozpoznání charakteristických mikrobiálních nebo apoptotických komponent slouží fagocytům různé druhy receptorů: • manózové receptory rozeznávající cukerné struktury na povrchu bakterií a některých virů • scavengerové receptory – rozeznávají acetylované LDL • chemotaktické receptory (fMLP) • Toll-like receptory • komplementové receptory • Fc receptory 3055755 3055755 RESPIRAČNÍ VZPLANUTÍ Stimulace povrchové membrány fagocytů – aktivace NADPH oxidázy – zvýšená spotřeba kyslíku a jeho přeměna na reaktivní kyslíkové deriváty O2- … superoxidový anion H2O2 … peroxid vodíku 1O2 … singletový kyslík HOCl ... kyselina chlorná OH. ... hydroxylový radikál DETEKCE KYSLÍKOVÝCH DERIVÁTŮ VZNIKLÝCH V PROCESU RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ •Zesílení přirozené chemiluminiscenční aktivity fagocytů přídavkem luminoforu. • energie chemické reakce •LUMINOFOR LUMINOFOR* • energeticky bohatší, nestabilní • • • • • •Uvolnění přebytečné energie ve formě světelných kvant registrovatelných fotonásobičem luminometru. 3055755 •Fagocytující buňky plná krev izolované polymorfonukleární buňky •Luminofory luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione) lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrát) •Aktivita spontánní stimulovaná •Stimulátory korpuskulární: škrob, opsonizovaný zymozan solubilní: phorbol myristát acetát 3055755 TEST CHEMILUMINISCENCE KINETIKA RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ •Vmax … maximální produkce fotonů •tmax … čas nutný k dosažení maximální produkce fotonů •Hodnota integrované plochy pod křivkou … vyjádření celkového množství fotonů vyprodukovaných systémem za definovaných podmínek 3055755 Vmax tmax PRACOVNÍ POSTUP •Odběr venózní krve do heparinu (5j heparinu/1ml krve). Krev 30 min inkubovat v termostatu při 37°C. Materiál zpracovat do 120 min po odběru. •Krev vyšetřit hematologicky (celkový počet leukocytů, KO). •U každého pacienta vyšetřit: spontánní aktivitu (bez stimulace) i stimulovanou aktivitu (stimulace 1% rýžovým škrobem). •Pipetovací schéma: 3055755 AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl • Měření chemiluminiscence luminometrem ve 3 minutových intervalech po dobu 45 min při teplotě 37oC. • Hodnocení výpočtem integrované plochy pro spontánní i stimulovanou aktivitu a její přepočet na 105 fagocytujících buněk. • Výpočet indexu metabolického vzplanutí (IMV). • Klinický význam vyšetření: • - diagnostika chronické granulomatózy (defekt NADPH oxidázy ) - defekt myeloperoxidázy (srovnání chemiluminiscence lucigenin-luminol) - vliv léčiv na fagocytózu - septické stavy l 3055755 DALŠÍ VYŠETŘENÍ FAGOCYTÓZY 3055755 •MIKROBICIDNÍ TEST -sledování schopnosti fagocytů pohlcovat a usmrcovat živé kvasinky; usmrcené kvasinky se z fagocytů uvolní deoxycholátem a jejich množství se určí obarvením methylenovou modří •NBT (INT) TEST -při aktivaci fag. vznikají kyslíkové deriváty (peroxid vodíku, superoxidový radikál) – tato aktivita je hodnocena redukcí tetrazoliových solí; -bezbarvý roztok soli proniká při fagocytóze do buňky, kde je redukován na nerozpustný barevný formazan; při extrakci měřitelný spektrofotometricky. NBT = nitrobluetetrazolium INT = iodonitrotetrazolium •Správná funkce fagocytů je pro organismus nezbytná!!! • (hlídání adekvátnost zánětlivé reakce na cizorodou částici: cizorodá vs. vlastní) • •Naopak hyperaktivace fagocytů – problémy: • poškození okolních buněk a tkání reaktivními metabolity a proteolytickými enzymy • •Deficience ve funkcích fagocytů = těžký průběh banálních infekcí • příklad: CGD (chronická granulomatóza) – defektní NADPH oxidáza (častá bakteriální a fungální onemocnění) • • KLINICKÝ VÝZNAM FAGOCYTÓZY 3055755