Nádorové (tumorové) markery Petr Breinek BC_TM_N2012 Logo MU.jpg Definice ØMohou být produkovány nádorovými buňkami (s nádorem asociované antigeny) nebo jinými tkáněmi jako jejich odpověď na maligní proces (indukované TM) Široké spektrum molekul (většinou proteinů) rozdílných vlastností, které se vyskytují se ve zvýšené koncentraci v nádorových tkáních nebo v krvi onkologických nemocných Negativní nález neznamená nepřítomnost nádoru Ø Universální tumorový marker, který by jednoznačně určil, zda jedinec má nebo nemá nádorovou chorobu není zatím znám Ø Jaký je význam stanovení TM? ØSledování efektu terapie/průběhu choroby ØNávrat choroby (remise) ØUpřesnění diagnózy ØUrčení prognózy ØPodezření na reziduální nádor Nádorové buňky ØNekontrovatelný růst určité části buněčné populace ØZměny v genomu/ enzymovém systému Ø ØJsou narušeny kontrolující a řídící mechanismy pro normální růst Rozdělení nádorů ØBenigní (nezhoubné) ØMaligní (zhoubné) Ø - karcinomy (epiteliální nádory) Ø - sarkomy (mesenchymální původ) Ø - hematologické nádory Ø - metastázy Ø (druhotné ložisko maligního nádoru) - Třídění tumorových markerů (podle výskytu) 1.Humorální (prokazované v krvi nebo jiných tělesných tekutinách) 2. 2.Celulární (buněčné, vyskytují se v nádorových buňkách nebo na jejich povrchu) Třídění tumorových markerů (podle biologické funkce) Ø1. Onkofetální a onkoplacentární antigeny (CEA,AFP, hCG) Ø Onkofetální antigeny – látky vytvářené organismem ve fetálním období(po narození se tvoří jen v souvislosti s nějakým onemocněním, nejčastěji nádorem) Ø Ø2. Karbohydrátové molekuly s epitopy rozpoznávané pomocí mAb (CA=carbohydrate antigen, CA125, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4) Ø3. Proliferační a diferenciační antigeny (TPS, PSA) Ø4. Hormony (hCG, ACTH, parathormon, kalcitonin) Ø5. Enzymy (NSE, TK, LD) Ø6. Specifické proteiny (ferritin, monoklonální imunoglobuliny/ paraproteiny) Ø Ø Ø7. Receptory (estrogenové, progesteronové) Ø8. Metabolity (metanefriny, katecholaminy) Ø9. Onkogeny a onkoproteiny (p53, BRCA1) Ø Ø Gen buněčného nebo virového původu zodpovědný za rychlý a nekontrolovaný růst živočišných buněk (mutovaný gen) Ø Vznikne z protoonkogenu, který po aktivaci je schopen vyvolat neoplastickou transformaci Onkogen ØGen buněčného nebo virového původu zodpovědný za rychlý a nekontrolovaný růst živočišných buněk (mutovaný gen) ØVznikne z protoonkogenu, který po aktivaci je schopen vyvolat neoplastickou transformaci Nádorové markery v éře molekulární medicíny Nové molekulárně biologické techniky vyšetřující na úrovni genu (DNA, mRNA), eventuelně proteomu (proteiny) Klasické sérové nádorové markery však mají stále mají nenahraditelné místo DNA - nádorové markery ØBRCA1 karcinom prsu Øp53 Li-Fraumeni syndrom ØK-ras kolorektální karcinom ØRB1 retinoblastom Øpřestavby blc-2 B lymfom Øpřestavby c-abl-bcr leukémie Tkáňové markery Ø Molekuly receptorové povahy ØEstrogenový receptor ØProgesteronový receptor Ø (Steroidní receptory, markery ca prsu, pozitivita je indikací k terapii antiestrogeny) ØReceptor pro IL-2 ØC-erb-B2, … Metody stanovení TM Ø1. Imunoanalytické metody Ø2. Metody molekulární biologie 3.Stanovení enzymů 4.Metody chromatografické 5.Metody elektroforetické Ø Další metody používané pro diagnostiku nádorů Ø Patologie Ø Histologie Ø Cytologie Ø Imunohistochemie Ø Průtoková cytometrie Ø Biofyzikální (rtg, CT, Sono, PET) ØMetody molekulární biologie Ø PCR, DNA mikroarray, proteomika Budoucnost •Mikročipové technologie •Genomová a proteomová analýza •Vysokorozlišovací dvojrozměrná elektroforéza •Hmotová spektrometrie Standardizace imunoanalytických metod na stanovení TM je nízká ØPříčiny: üNízká specifita používaných protilátek,které jsou orientované proti nestejným epitopům üAntigen existuje ve více izoformách üInterference Ø Nejčastěji používané principy IA Ø Øa) Fluorescenční metody Ø (FIA, FPIA, DELFIA, TRACE, ..) Øb) Enzymová imunoanalýza, EIA Ø (EMIT, ELISA, MEIA, CEDIA, ..) Øc) Luminiscenční imunoanalýza Ø (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,..) Vyjadřování výsledků ØKoncentrace TM v krvi jsou velmi nízké ØVětšina TM vykazuje heterogenitu ØNeexistuje certifikovaný referenční materiál Ø Jednotky koncentrace: Ø Látkového množství (ug/l a ng/l) Ø Biologická nebo imunologická aktivita (U/l, kU/l) Ø Frekvence vyšetření TM ØPřed nasazením terapie ØPo skončení terapie Ø1 měsíc v prvním roce po primární terapii Ø2 měsíce ve druhém roce Ø3 měsíce v dalších letech sledování Øpři změně terapie ØPři nejasném průběhu nemoci Diagnostický rozhodovací limit Cut-off ØPojmem cut-off se rozumí hodnota výsledku laboratorní zkoušky, která rozliší jedince s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti s danou: ØSenzitivitou a specificitou ØVěrohodností ØPrediktivní hodnotou ØHodnota zvolená na bázi konsenzu odborníků Ø Klinická specifita Ø Udává procento správně negativních výsledků ze souboru zdravých. Ø Ø Čím vyšší specifita, tím je méně falešně pozitivních výsledků. Doporučení: >95% Klinická senzitivita (citlivost) Ø Udává procento správně pozitivních výsledků ze souboru nemocných. Ø Ø Čím vyšší sensitivita, tím je méně falešně negativních výsledků. Doporučení: >50% pre23 Ideální stav zdraví nemocní koncentrace Rozhodovací limit 100% specifita 100% senzitivita Realita: smíšená populace zdraví nemocní koncentrace Rozhodovací limit Falešně negativní Falešně pozitivní TM hodnoceni2 Příklad interpretace: Software BIANTA (Bayesian Inteligent Associative Network for Tumor Analysis) Příklad interpretace: Software CRACTES (Cancer Recurrence, Analysis, Correlation, Testing, Statistics) Stanovení pravděpodobnosti návratu choroby nebo její progrese Významné změny hladin nádorových markerů ØBez terapie Ø výrazný nárůst koncentrace ve třech následujících odběrech ØBěhem terapie Ø nárůst o >25% progrese onemocnění Ø pokles o >50% částečná remise ØMatematicko-statistické postupy Diagnostické využití Typ nádoru Hlavní Vedlejší Tlusté střevo, rektum CEA, CA19-9 Žaludek CEA,CA72-4 CA19-9 Pankreas CA19-9, CEA CA125 Prs CA15-3, CEA CA125, TPS Ovarium CA125,CA19-9 CA72-4 Děloha SCCA, CA125 CEA Diagnostické využití Typ nádoru Hlavní Vedlejší Plíce (malobuněčný) NSE, CEA TPS Plíce (nemalobuněčný) CYFRA 21-1 SCC Germinální nádory hCG, AFP NSE Játra AFP, CA19-9 CEA Močový měchýř TPA,TPS CYFRA 21-1 Prostata PSA, FPSA Hematoonkologické TK, B2M paraprotein Možnost zvýšení hodnot TM u benigních onemocnění TM Nemaligní onemocnění Jiná příčina CEA Zánětlivé choroby jater, jaterní cirhóza, pankreatitida Kouření AFP Zánětlivé procesy plic, GIT, jaterní cirhóza, akutní a chronická hepatitida TPA Infekční procesy, jaterní cirhóza, pankreatitida CA15-3 Jaterní cirhóza, akutní hepatitida, postižení ledvinných glomerulů CA125 Ovariální cysty, choroby jater, pankreatu, žlučníku Těhotenství (1.trimestr) CA19-9 Jaterní cirhóza, cholelithiáza, chronická hepatitida, akutní a chronická pankreatitida,choroby žlučových cest, diabetes hCG Mola hydatidóza Těhotenství B2M Postižení ledvin Ferritin Záněty obecně, poruchy metabolizmu železa CYFRA21-1 Choroby urologického traktu, myomy/ovariální cysty Enzymy ØLD (laktátdehydrogenáza) ØNSE (nespecifická enoláza) ØPSA (prostatický specifický antigen) ØTK (thymidinkináza) ØACPP (prostatická kyselá fosfatáza) ØTumor M2-PK (izoenzym pyruvátkinázy) NSE (neuronspecifická enoláza) ØCytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy (katalyzuje přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát) Ø Vyskytuje se jako dimer (αγ a γγ) ØFyziologicky je produkován v nervové a plicní tkáni vyvíjejícího se plodu, v dospělosti v různých strukturách neuroendokrinního původu NSE (neuronspecifická enoláza) ØZvýšené hodnoty: Ø - malobuněčný plicní karcinom, nádory mozku (neuroblastomy) a neuroendokrinního systému (feochromocytom) ØNespecificky zvýšené hodnoty: Ø - nemaligní plicní onemocnění, Ø jaterní choroby, hemolýza, zranění mozku PSA (prostatický specifický antigen) ØFyziologicky syntetizován v epitelu prostaty u zdravých osob, ve zvýšené míře u nemocných s hyperplázií a s ca prostaty. ØGlykoprotein (10% sacharidů), působí jako serinová proteáza ØVyskytuje se ve volné formě (FPSA) a ve formě komplexů (PSA-AMG a PSA-ACT) ØAMG=alfa2-makroglobulin ØACT=alfa1-antichymotrypsin PSA (prostata specifický antigen) ØZvýšené hodnoty: Ø Benigní hyperlázie prostaty (BHP) a maligní hypertrofie prostaty (ca prostaty) ØNespecifické zvýšení: Ø záněty prostaty (prostatitidy), mechanické dráždění prostaty (vyšetření „per rectum“, jízda na kole) PSA (prostata specifický antigen) ØReferenční metoda: není k dispozici ØCRM: není k dispozici Ø ke standardizaci se zatím používá standard WHO 96/670 ØTMU: 15% ØReferenční hodnoty: do 49 let <2,5 µg/l Ø do 59 let <3,5 µg/l Ø do 69 let <4,5 µg/l Ø nad 69 let <6,5 µg/l 41 41 Volný PSA (FPSA) nZvýšená specifita vyšetření nPoměr FPSA/PSA n pro „šedou zónu“ PSA 4-10 μg/l n0-15% malignita n15-25% malignita i benigní hyperlazie nnad 25% benigní hyperplazie n n TK (thymidinkináza) ØEnzym podílející se na syntéze DNA, umožňuje syntézu DNA náhradní cestou, ukazatel buněčné proliferace Øthymidin + ATP → thymidinmonofosfát Ø(ATP:thymidin-5-fosfotransferáza) Ø Ø2 izoenzymy: TK1 (fetální) v séru 95% Ø TK2 („dospělý“) TK (thymidinkináza) ØZvýšené hodnoty: Ø - hematoonkologické malignity, plicní karcinom, ca kůže ØNespecifické zvýšení: Ø - nemaligní plicní onemocnění, virové choroby, revmatické choroby, léčba některými cytostatiky (MTX) Ø Onkofetální antigeny ØAFP ØCEA AFP (alfa fetoprotein) ØSyntetizován již během vývoje plodu, mizí po porodu. Hlavním zdrojem je žloutkový vak, fetální játra a GIT. ØGlykoprotein (4% sacharidů, Mr 70 000) podobný albuminu, popsán 1963 ØRůzné molekulové varianty lišící se v glykosylaci ØProf.MUDr. J. Masopust Dr.Sc. prof.Masopust.jpg AFP (alfa fetoprotein) ØSoučást screeningu vrozených vývojových vad (v 2. trimestru) ØZvýšené hodnoty: Ø - ca hepatocelulární, testes, ovaria, žaludek, pankreas ØNespecifické zvýšení: Ø hepatitidy, fyziologicky v graviditě, fetální abnormality, alkoholismus,cirhóza a selhání jater AFP (alfa fetoprotein) ØReferenční metoda: není k dispozici ØCRM: není k dispozici Ø ke standardizaci se zatím používá standard WHO 72/225 (IRMM BCR-486) Ø ØTMU: 20% ØReferenční hodnoty: <10 ug/l Ø CEA (Karcinoembryonální antigen) ØFyziologicky je syntetizován během embryonálního a fetálního období. Hlavním zdrojem je povrch sliznic převážně v gastrointestinálním traktu a v pankreatu. ØGlykoprotein (50% sacharidů, 641 AK, Mr 180 000) ØRůzné molekulové varianty lišící se v glykosylaci, existuje >36 variant, ovlivňuje buněčnou adhezi CEA ØZvýšené hodnoty: Ø - kolorektální ca, ca žaludku, ca pankreatu, ca plic,prsa,játra ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, pankreatitida, kuřáci, alkoholismus, zánětlivé střevní, plicní a žaludeční onemocnění, hepatitidy, autoimunní choroby Fragmenty komplexních glykoproteinů,jejichž epitopy jsou rozpoznávané monoklonálními protilátkami ØCA19-9 (také GI-CA, GI-MA) ØCA15-3 ØCA125 ØCA72-4 CA 19-9 ØIzolován z buněk kolorektálního karcinomu hybridizační technologií ØVyskytuje se jako glykoprotein ve tkáních (glykolipid) nebo v krvi (mucin) a sekretech ØPříbuzný antigenu krevní skupiny Lewis a/b ØRůzné molekulové varianty ØNení nádorově ani orgánově specifický CA 19-9 ØZvýšené hodnoty: Ø - diferencované ca pankreatu a žlučových cest, kolorektální ca, žaludek, játra ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, hepatitida, pankreatitida, onemocnění žlučových cest, diabetes,.. Ø3-7% populace tento antigen netvoří (krevní skupina Lewis a/b negativní) Ø CA 19-9 ØReferenční metoda: není k dispozici ØCRM: není k dispozici Ø ke stanovení se používá monoklonální protilátka (1116NS 19-9, firma Centocor) Ø ØTMU: SEKK (2008) 20% ØReferenční hodnoty: <35 kU/l Ø CA15-3 ØGlykoprotein diferenciačního typu (ochrana epiteliálních struktur?),produkován především nádory žlázového epitelu a epitelu mléčné žlázy ØZvýšené hodnoty: Ø ca prsu, ovaria, děložního čípku, prostaty, plic a kolorektálního karcinomu ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, plicní choroby, GIT, renální poruchy CA125 ØGlykoprotein s vysokým obsahem sacharidů ØSyntetizován především v epiteliálních buňkách u ca ovárií ØZvýšené hodnoty: Ø ca vaječníků (ovárií), gynekologické tumory,ca plic, hepatocelulární karcinom ØNespecifické zvýšení: Ø gravidita, gynekologické choroby, GIT,selhání ledvin, chronické onemocnění jater CA72-4 (tumor asociovaný antigen, TAG 72 Ø ØGlykoprotein (mucinový komplex) ØZvýšené hodnoty: ca jícnu, GIT, žaludku, pankreatu, ovaria, střeva ØNespecifické zvýšení: choroby jater,ledvin,zánětlivá onemocnění, vředová choroba žaludku, GIT Fragmenty cytokeratinů ØTPS ØTPA ØCYFRA21-1 TPA (Tkáňový polypeptidový antigen) ØAntigen odpovídající solubilním fragmentům cytokeratinu 8,18,19) ØMarker proliferační aktivity nádorových buněk ØZvýšení: Ø ca ledvin,močový měchýř, plíce, prsa ØNespecifické zvýšení: Ø infekce, choroby jater, ozařování TPS (Tkáňový polypeptidový specifický antigen) ØAntigen odpovídající solubilním fragmentům cytokeratinu 18) ØMarker proliferační aktivity nádorových buněk ØZvýšení: Ø ca ledvin,močový měchýř, plíce, prsa ØNespecifické zvýšení: Ø infekce, choroby jater, ozařování CYFRA 21-1 (solubilní fragment cytokeratinu) ØEpiteliální buňky skvamózního (epidermoidního) typu ØZvýšení: Ø - ca plic, močového měchýře, cervix, žaludku,pankreatu, prostaty, hlavy a krku ØNespecifické zvýšení: Ø zánětlivá plicní onemocnění, infekce, TBC hCG (lidský choriogonadotropin) ØGlykoprotein tvořený podjednotkami alfa a beta (dimer) ØMůže docházet k disociaci na podjednotky ØBeta podjednotka může být štěpena na gonadotropinový peptid (beta-core fragment) ØStanovuje se: celkový β-hCG (dimer+volná β-podjednotka),intaktní hCG (bez volné β-podjednotky),volná β-podjednotka, beta-core fragment hCG (lidský choriogonadotropin) ØSyntetizován placentou ihned po početí ØZvýšené hodnoty: Ø choriokarcinom, ca testes ØNespecifické zvýšení: Ø těhotenství, cysty ovarií SCCA (Antigen skvamózních buněk) ØZa fyziologického stavu je produkován diferencovanými epidermoidními buňkami plodu i dospělých osob (glykoprotein) ØZvýšené hodnoty: (ca buněk dlaždicového epitelu) Ø - ca děložního čípku a další gynekologické Ø nádory, nádory ORL oblasti (hlava, krk) ØNespecifické zvýšení: Ø gynekologické, plicní a jaterní choroby Ferritin ØProtein podílející se na regulaci homestázy železa, slouží k uskladnění železa ve tkáních ØZvýšené hodnoty: Ø - hematoonkologické malignity, lymfomy,mnohočetný myelom, plíce, melanom, játra, slinivka, prs, varle ØSnížené hodnoty: Ø - anémie z nedostatku železa Ø Také: Ø - akutní záněty, hemosideróza, hemochromatóza Beta-2-mikroglobulin, B2M Ø ØZvýšené hodnoty: Ø - krevní malignity (mnohočetný myelom, chronická lymfocytární anémie) Ø Nespecifické zvýšení: Ø - postižení ledvin, revmatoidní arthritis, imunodeficience Ø Další TM Ø ØS-100B ØChromogranin A (CgA) Monoklonální imunoglobuliny Ø ØParaproteiny Ø abnormální imunoglobuliny produkovány proliferujícím klonem plazmatických buněk, případně B-lymfocytů Ø ØVolné lehké řetězce Ø (Bence-Jonesova bílkovina v moči) 30 PROTEINE 4 IF Hormony a jejich metabolity ØhCG ØPTH ØACTH ØKalcitonin ØGastrin ØProlaktin ØNorepinefrin Øepinefrin 71 71 Závěr n n Nádorové markery nelze přeceňovat, n ale ani zatracovat. n n