Stanovení katalytické aktivity enzymů, volba  podmínek.



Uveďte hlavní faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce.


Vliv tepoty

1. Popište závislost rychlosti enzymové reakce na teplotě. Znázorněte grafické závislosti aktivity
enzymu na čase pro hypotetický enzym a teploty 10^o,20^o, 30^o ,35^o ,40^o,50^o ,^ 80^o. Vyberte
vhodnou teplotu pro danou enzymovou reakci.


Vliv pH

2. Charakterizujte vliv pH na průběh enzymové reakce.

3. Vysvětlete, co je to pufr. Jak vyhledáte vhodný pufr pro enzymovou reakci?

4. Pro jaké pH jsou vhodné následující pufry?

HEPES neboli N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, p[KA] = 7.31 při 37°C a 7.55 při
20 °C.

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, p[KA] při 20°C je 8.3

Meg (N-methylglukamin) – pak = 9,52

5. Jaké jsou další požadavky na dobrý pufr?




Kvantifikace enzymu


jednotka                                             rozměr

Katalytická (enzymová) aktivita          katal (kat)                                           . .
. . . .

                                                           mezinárodní jednotka (U,
IU)                mmol/min

Katalytická koncentrace                    . . . . . .
. . . . . .


Hmotnostní koncentrace                       g/l
    g/l


Uveďte vztah pro přepočet katalytické aktivity v mkat na IU a opačně.


6. Jaké metody stanovení katalytické koncentrace jsou užívány? Která je v praxi nejčastější?

7. Vysvětlete pojem lag-fáze u enzymové reakce.


8.      Laktátdehydrogenasa má katalytickou aktivitu 2 mkat. Kolik molekul laktátu vznikne z
pyruvátu za 1 minutu při nadbytku substrátu?
                                  (7,23.10^19)

9.      Jaké množství produktu vznikne za 10 minut při reakci katalyzované enzymem o aktivitě 10
mkat? Co je podmínkou toho, aby teoreticky vypočtené množství skutečně
vzniklo?                                (6 mmol)

10.  Do reakční směsi obsahující substrát a pufr bylo přidáno 0,1 ml séra. Jaká je katalytická
koncentrace enzymu, jestliže po 10 minutách měření metodou konstantního času obsahovala reakční
směs 6.10^-3 mmol produktu? Bude se výsledek lišit od aktivity stanovené kinetickou metodou?

                 (100 mkat/l)

11.  Reakční směs obsahuje: 2,5 ml pufru, 0,2 ml roztoku NAD^+, 0,1 ml séra a 0,2 ml roztoku
laktátu. Reakce probíhala přesně 10 minut a po této době byla naměřena koncentrace vzniklého NADH
0,0012 mol/l. Vypočtěte katalytickou aktivitu a katalytickou koncentraci enzymu LD. (6 nkat, 60
mkat/l)

12.  Určete aktivitu katalasy, bylo-li zjištěno, že při nadbytku H[2]O[2] v reakční směsi se uvolní
po 10 minutách 6,72 ml O[2 ](za normálních podmínek).
                       (1 nkat)


13. Jak se využívá NAD^+ ke stanovení aktivity enzymů?



Optický (UV, Warburgův) test
















14.   Jak se bude měnit absorbance při 340 nm při stanovení laktátu v séru s využitím optického
testu?