Stanovení hemoglobinu v krvi Nejběžnější stanovení Hb ve venosní nebo kapilární krvi je založeno na reakci s kyanidem sodným a hexakyanoželezitanem draselným. Reakce se provádí v prostředí pufru N-methylglukaminu. Principem této reakce je vznik derivátu hemoglobinu. Popište, o jaký derivát se jedná: Měří se absorbance při 540 nm (proti roztoku činidla), obvykle po 5 minutách. Při této vlnové délce má vzniklý derivát jediné absorpční maximum ve viditelné oblasti při 540, molární absorpční koeficient ε[540]=11 000 l.mol.cm^-1. Odvoďte vztah pro výpočet koncentrace hemoglobinu za předpokladu, že objem vzorku krve byl 0,02 ml a objem přidaného činidla 5 ml. Ø Zvažte, že hemoglobin je tetrametr a posuďte, zda vztah, který jste odvodili pro výpočet, platí pro monomer nebo tetrametr. Referenční hodnoty pro tetrametr: Muži 2,15-2,65 mmol/l Ženy 1,86-2,35 mmol/l Ø Jaké budou referenční hodnoty v g/l a) pro tetrametr b) pro monomer ? Ø Znáte jinou metodu pro stanovení hemoglobinu ? Popište její princip. Stanovení karbonylhemoglobinu Srovnání spekter oxyhemoglobinu a karbonylhemoglobinu Název symbol Absorpční pík 1 l Absorpční pík 1 l Absorpční pík 1 l Hemoglobin Oxyhermoglobin Karbonylhemoglobin Methemoglobin Kyanomethemoglobin Hb HbO[2] HbCO Hi HiCN 431 415 420 406 421 555 542 539 500 540 577 568,5 630 Princip stanovení: ke krvi je přidán hydrogensiřičitan sodný (redukční činidlo), který přemění oxygenovaný Hb na deoxygenovanou formu. Koncentrace CO-Hb se zjistí fotometricky. Ø Při jaké vlnové délce může probíhat měření ? (Moderní fotometry provádí měření automatizovaně při několika vlnových délkách a vypočítají koncentrace jednotlivých forem hemoglobinu). Stanovení glykovaného hemoglobinu HbA[1] Glykovaný hemoglobin vzniká neenzymovou reakcí mezi hemoglobinem a glukosou v krvi Jeho tvorba je ireverzibilní. Hladina glykovaného hemoglobinu proto odráží koncentraci glukosy v krvi po celou dobu existence erytrocytu, tj. asi 120 dní, a využívá se k posouzení úspěšnosti léčby/kompenzace diabetu v období 4–8 týdnů před vyšetřením. Nejčastěji se stanovuje forma HbA[1c]. Terminologie: Glykovaný hemoglobin - suma sacharidových aduktů na N-terminálním konci aminokyselin nebo e‑aminoskupině lysinu v hemoglobinu. HbA[1][ ]- suma různých minoritních frakcí hemoglobinu (glykovaných), včetně HbA[1c], HbA[1a1/a2], HbA[1b1/b2/b3], HbA[1d1/d2/d3] a HbA[1e]. HbA[1c] - glukosový adukt valinu na N-terminálním konci b-řetězce hemoglobinu; odpovídá N‑[1‑deoxyfruktosyl]hemoglobinu, tzv. stabilnímu ketoaminu. Princip testů Koncentrace celkového Hb a HbA1c je stanovena po hemolyzování vzorků plné krve s antikoagulantem. Ø Uveďte principy stanovení HbA[1c] používané ve vaší laboratoři. Stanovení bilirubinu Bilirubin reaguje s diazoniovými solemi (podobně jako aromatické aminy a fenoly) za vzniku intenzivně zbarvených azosloučenin, vhodných k fotometrickému stanovení. Reakce nekonjugovaného bilirubinu probíhá velmi pomalu, značně ji urychlí přídavek alkoholu nebo jiných látek (benzoát sodný, kofein, močovina atd.), které se souhrnně označují jako akcelerátory reakce. Ø Proč je reakce s nekonjugovaným bilirubinem pomalá ? Ø Jak vypadá konjugovaný bilirubin? Proč je rozpustnější ? Frakce bilirubinu, která vyžaduje akcelerátor, se označuje jako „nepřímý bilirubin“. Konjugovaný bilirubin reaguje i bez akcelerátorů rychle („přímý bilirubin“). Nekonjugovaný bilirubin se vypočítá jako rozdíl mezi celkovým a konjugovaným bilirubinem. V metodě se používá nejčastěji diazotace sulfanilové kyseliny, jako akcelerátor kofein a benzoát, barevný produkt se měří v silně alkalickém prostředí. V přítomnosti akcelerátoru reagují všechny formy bilirubinu, stanovujeme celkový bilirubin. Ø Jakou metodu stanovení bilirubinu používá vaše laboratoř ? Referenční interval koncentrace celkového bilirubinu v krevním séru pro novorozence starší 1 měsíce a dospělé je 5–20 mmol/l. Koncentrace konjugovaného bilirubinu je nejvýše 5 mmol/l. Hodnoty nekonjugovaného bilirubinu 17–70 µmol/l spolu s normálním nálezem ostatních vyšetření jsou charakteristické pro chronickou hemolýzu (hemolytická anémie) a pro benigní hyperbilirubinemii Gilbertova typu (pokles aktivity UDP-glukuronyltransferázy). Do určité míry je fyziologická postnatální hyperbilirubinemie (donošení novorozenci ve 2.-3. dnu života mohou mít v séru až 135 mmol/l nekonjugovaného bilirubinu, do 170 mmol/l celkového bilirubinu), rychle se upravující na hodnoty obvyklé u dospělých. Zjištění bilirubinu v moči V moči zdravého člověka se může vyskytovat nepatrné množství konjugovaného bilirubinu (až 0,5 mmol/l), které běžnými zkouškami není prokazatelné. Moč k důkazům bilirubinu musí být čerstvá, bilirubin se na vzduchu snadno oxiduje. K důkazu se obvykle používá některý z diagnostických proužků obsahující zónu pro detekci bilirubinu. Tato zóna je nasycena vhodnou diazoniovou solí, s níž bilirubin poskytne barevnou azosloučeninu. Hodnocení Zkoušky na bilirubin v moči jsou pozitivní, zvýší-li se koncentrace konjugovaného bilirubinu v krevní plazmě asi nad 30 mmol/l. Nekonjugovaný bilirubin je v plazmě vázán na albumin a do glomerulárního filtrátu proto neproniká. Zjištění bilirubinu v moči je tedy známkou neschopnosti hepatocytů vyloučit konjugovaný bilirubin do žluče nebo známkou uzávěru žlučových cest, patří proto k příznakům hyperbilirubinemie hepatocelulární nebo obstrukční. Při déletrvajících poruchách však nemusí být v moči prokazatelný ani kojugovaný bilirubin, neboť se v séru přeměňuje na delta formu. Zjištění urobilinogenů v moči Zkoušky na přítomnost urobilinogenů se provádějí jen v čerstvé (a zchladlé) moči (vhodná polední nebo odpolední moč), během prvních dvou hodin po vymočení; delším stáním se urobilinogeny přeměňují na své oxidační produkty - urobiliny. Princip: Průkazem Ubg je specifická barevná kopulační reakce urobilinogenů s vhodnou diazoniovou solí v kyselém prostředí. Srovnání s barevnou stupnicí umožní semikvantitativní vyhodnocení. Slabě růžové zabarvení zóny, odpovídající prvnímu políčku srovnávací stupnice (přibližně 17 mmol/l), lze považovat za horní mez fyziologických koncentrací urobilinogenů v moči v průběhu dne.