1 Syntéza proteinů ÓBiochemický ústav LF MU (E.T.) 2012 2 Syntéza proteinů - translace Které buňky: v buňkách obsahujících DNA Kde v buňce: ribosomy (volné nebo vázané na ER) mitochondrie Rozdíly mezi eukaryoonty a prokaryonty: prokaryonty: transkripce, úpravy transkriptu a translace nejsou prostorově odděleny eukaryonty: translace probíhá až je zralá mRNA dopravena do cytoplazmy 3 Molekuly a další species potřebné pro syntézu proteinů Látka Funkce Aminokyseliny Substráty proteosyntézy Řada enzymů Katalyzátory Bílkovinné faktory efektory ATP, GTP energie Anorganické ionty (Mg2+, K+) Kofaktory enzymů tRNA Přenos AK na ribosu mRNA Určuje pořadí AK v proteinu rRNA Strukturní role, katalyzuje vznik peptidové vazby 4 Genetický kód Proteiny – 20 AK RNA – 4 báze Každá aminokyselina je charakterizována tripletem bází v mRNA – kodonem Celkem 64 kodonů → 61 kóduje aminokyseliny 3 jsou STOP kodony (UAA, UAG, UGA) Nierenberg (1961) – poly(U) sekvence mRNA je předlohou pro syntézu polyfenylalaninu Þ sekvence UUU je kódem pro fenylalanin 5 První Báze Druhá báze Třetí báze 5´ U C A G 3´ Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Genetický kód 6 Vztah mezi mRNA a proteinem •Sekvence bází v mRNA je roztříděna do kodonů •Startovací kodon zahajuje čtení úseku •Pořadí kodonů v mRNA určuje pořadí, ve kterém jsou aminokyseliny připojovány v rostoucím polypeptidovém řetězci – čtení je určeno čtecím rámcem ……A U G C A C A G U G G A G U U………. Zlý pes byl sám Z lýp esb yls ám > 7 Efekt mutací Mutace jsou výsledkem poškození nukleotidů v DNA nebo neopravených chyb během replikace. Mohou být přepsány do mRNA Translací chybné báze může v proteinu vzniknout abnormální sekvence AK 8 Typy mutací 1. bodové výměna jediné báze a) mírné - neovlivní sekvenci AK v proteinu např. CGA®CGG (obě sekvence kódují Arg) b) měnící smysl – jedna AK je zaměněna jinou např. CGA®CCA vyvolá záměnu Arg® Pro c) nesmyslné – vyvolají předčasnou terminaci řetězce např. CGA ®UGA, kodon pro Arg ® STOP kodon 9 Typy mutací (pokr.) 2. inserce – vložení jednoho nebo více nukleotidů 3. delece – vypuštění jednoho nebo více nukleotidů Porucha záleží na počtu vypuštěných nebo vložených nukleotidů Jsou-li vypuštěny tři nukleotidy, nebo více trojic nukleotidů při zachování čtecího rámce, dojde k tvorbě polypeptidu s chybějícími AK Je-li vypuštěn jeden nebo dva nukleotidy, dojde ke změně čtecího rámce a vznikají zkomolené sekvence AK, nesmyslné kodony atd. 10 Příklad bodové mutace Bodové mutace v genech pro hemoglobin: Je známo asi 800 strukturních variant lidského hemoglobinu Většina je způsobena bodovou mutací a je neškodná. Některé však vyvolávají choroby. Methemoglobinemie – např. nahrazení jednoho histidinu tyrosinemÞbílkovina je nepřístupná pro působení methemoglobin reduktasy, zvyšuje se methemoglobin v krvi (HbM) Srpková hemoglobinemie – nahrazení glutamátu valinem v pozici 6 b-řetězce Þ řetězec je méně rozpustný, dochází k řetězení Þ srpkovitý tvar erytrocytů (HbS) Příklad nonsense mutace b0-thalasemie Způsobena mutací na kodonu 17 v obou allelách, která způsobuje předčasnou terminaci syntézy b-řetězce 11 Aminokyseliny nemohou přímo reagovat s bázemi „adaptérem jsou tRNA molekuly“ • každá molekula tRNA obsahuje antikodon • antikodon je triplet bází komplementárních ke kodonu mRNA • každá tRNA může vázat specifickou AK na svém 3´-konci Syntéza proteinů podle kodonů v cytoplazmě, ve vazbě na ribosomy Fáze translace A.Inciace B.Elongace C.Terminace 12 antikodon Variabilní smyčka D-smyčka T-smyčka (TYC) Vazba na povrch ribosomu 5´konec Struktura tRNA 3´-konec, akceptorová stopka připojení AK esterovou vazbou k 3´-OH ribosy 13 Tvorba aminoacyl-tRNA 1. aminokyselina je nejprve aktivována reakcí s ATP na aminoacyl-AMP 2. aktivovaná AK je přenášena na 2´- nebo 3´- OH skupinu ribosy na 3´konci tRNA - reakce 2 je katalyzována specifickými enzymy (aminoacyl-tRNA synthetasy) a vyžaduje dodání energie • 14 Aminoacyl-tRNA syntetasy (nejméně 20 různých enzymů v buňce) vykazují vysoký stupeň specifity pro aminokyseliny. Enzym rozpoznává jak aminokyselinu, tak specifickou tRNA. Chyba 1 : 10 000. Tato vysoká specifita se často nazývá 2.genetický kód Závisí na lokalizaci určitých bází v tRNA, nikoliv na antikodónu 15 Ribosomy Ribonukleoproteinové částice – složené z RNA a proteinů Tvořeny velkou a malou podjednotkou V inaktivním stavu podjednotky odděleny, při zahájení proteosyntézy agregují. Na větší podjednotce tři vazebná místa pro molekuly tRNA – P, A, E P-peptidyl-tRNA A-aminoacyl-tRNA E-volná tRNA (exit) Větší podjednotka katalyzuje tvorbu peptidové vazby mezi aminokyselinami. Menší podjednotka váže mRNA a kontroluje správné párování bází mezi kodonem a antikodonem E P A 16 Prokaryotické x eukaryotické ribosomy Vlastnost Bakteriální Lidský Sedimentační konstanty: kompletní ribosom Menší podjednotka Větší podjednotka Obsah RNA RNA-menší podjednotka RNA-větší podjednotka Umístění v buňce 70S 30S 50S 65 % 16S 5S 23S Volně v cytoplazmě nebo vázané na plazmatickou membránu 80S 40S 60S 50 % 18S 5S 5,8S 28S Volně v cytoplazmě nebo vázané na membrány ER 17 Vazba m-RNA k preiniciačnímu komplexu Komplex skenuje mRNA od 5´konce, dokud nenarazí na sekvenci AUG Reakce spotřebovává ATP pro rozvinutí vlásenkovité struktury mRNA G GTP eIF2 UAC A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- m-RNA > 18 UAC A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- A P E Iniciační komplex 80S • GTP je hydrolyzováno • eIF se oddělí Pi + GDP eIF •připojí se větší ribosomální podjednotka •Met-tRNA se váže v P-místě větší podjednotky ribosomu Met > 19 Elongace peptidového řetězce • tvorba další aminoacyl-tRNA • vazba aminoacyl-tRNA do místa A ribosomu • tvorba peptidové vazby • translokace peptidyl-tRNA do místa P 20 UAC A P E Která další AK bude připojena? Další kodon je UUG Antikodon je AAC Aminokyselinou je leucin A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- 21 UAC A P E A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- AAC Met Leu Leu-tRNA se váže do místa A A P E GTP je hydrolyzováno na GDP + Pi, komplex GDP-EF1a se uvolní GDP-EF1a Pi Proces elongace je u prokaryotů a eukaryontů velmi podobný (odlišné kofaktory elongace) 22 UAC A P E A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- AAC Met Leu A P E Tvorba peptidové vazby (transpeptidace) Peptidyltransferasa katalyzuje odštěpení methioninu od tRNA a přenesení na leucin za vzniku peptidové vazby Vazebné místo na 3´-konci tRNAMet je volné Peptidyltransferasa je rRNA. Je to složka 28S RNA podjednotky 60S – ribozymová aktivita Syntéza proteinů začíná N-koncem 23 UAC A P E A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- AAC Met Leu A P E Přesun Met-tRNA do místa E 1. k ribosomu se váže EF2 a GTP EF2 + GTP 2. tRNAMet se přesouvá do místa E, P místo se uvolní G > 24 A P E A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- AAC Met Leu A P E Výsledek animace na obr.37 Přesun met-tRNA do místa E UAC G 25 A P E A C C G U A A C A U G U U G C C G 5´-P-P-P-5´- AAC Met Leu A P E Translokace a uvolnění Met-tRNA Vzájemný posun ribosomu a mRNA o jeden kodon, místo A se uvolní GDP-EF2 + Pi Směr posunu GTP je hydrolyzováno, EF se uvolní > 26 Další cyklus elongace Do místa A se navazuje další tRNA s navázanou AK (prolin) Které další kroky budou následovat ? 27 Terminace • Elongace pokračuje dokud se terminační (Stop) kodon neposune k místu A na ribosomu • V cytoplazmě není žádná tRNA schopná vázat se ke Stop- kodonu • K ribosomu se navážou uvolňovací faktory (releasing factors) • Peptidyltransferasa hydrolyzuje esterovou vazbu mezi peptidovým řetězcem a tRNA • Nově syntetizovaný peptid je uvolněn z ribosomu • Ribosom disociuje na podjednotky, mRNA se uvolní 28 Polysomy NH2 NH2 NH2 NH2 Zatímco jeden ribosom se pohybuje podél mRNA a produkuje polypeptidový řetězec, další ribosom se může vázat do prázdného místa na 5´-konci. Současně může na jedné mRNA působit mnoho ribosomů (s odstupem cca 80 nukleotidů = polyribosom (polysom) Simultánní translace mRNA na více ribosomech 5´ 3´ 29 Syntéza proteinů v mitochondriích •Mitochondrie obsahují 2-10 kopií uzavřené kruhové, dvouvláknové DNA •Velikost kolísá v závislosti od druhu •Živočišná mitochondriální DNA má Mr~ 107 •Kóduje rRNA, sadu tRNA a mRNA pro několik proteinů DŘ •Proteiny syntetizované v mitochodriích jsou nepatrnou frakcí proteinů vnitřní mitochondriální membrány, jsou však esenciální pro průběh oxidativní fosforylace (část komplexů I,III,IV a ATP synthasy) •Syntéza proteinů v mitochodriích má řadu rysů shodných se syntézou u prokaryontů (iniciace formylmethioninem, citlivost k antibiotikům atd.) 30 Antibiotikum Účinek Streptomycin Váže se k 30S ribosomální podjednotce, inhibuje tvorbu iniciačního komplexu.Vyvolává chyby ve čtení mRNA. Tetracyklin Váže se k 30S ribosomální podjednotce a inhibuje vazbu aminoacyl-tRNA do místa A Chloramfenikol Váže se k 50S ribosomální podjednotce a inhibuje peptidyltransferasu Erytromycin Váže se k 50S ribosomální podjednotce a inhibuje translokaci Puromycin Obsazuje A-místo ribosomu a vyvolává předčasnou terminaci Účinky antibiotik na proteosyntézu bakterií • Při působení antibiotik jsou využívány rozdíly v mechanismu proteosyntézy u eukaryontů a prokaryontů • Některá antibiotika reagují specificky s proteiny bakteriálních ribosomů 31 File:Protein folding schematic.png Skládání proteinů (folding) Nascentní polypeptidový řetězec je transportován z ribosomů Postupně se dostává mimo „chráněnou“ oblast ribosomu a nastává jeho prostorové skládání 32 http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ne0000/ne0000/14463077/f3_dobson_nature02261-f 2.2.jpg Skládání proteinů 33 •Polypeptidový řetězec se sbalením dostává do prostorových konformací – pouze jediná je správná a odpovídá nativnímu stavu. •Jiné konformace mohou vzniknout např. účinkem tepla, chemikálií, ozáření, oxidačním stresem atd. Skládání je regulováno chaperony. •Špatné sbalení proteinů může vyplývat z mutace genu • Špatně sbalené proteiny jsou cílem ubikvitinace a jsou degradovány v proteasomu. •Akumulace velkého množství špatně sbalených proteinů může nastávat při nadprodukci proteinu, poškození nebo disfunkci. •Vznikají proteinové shluky (amyloid), které mohou vést k poškození a zániku buňky. Folding 34 Poruchy ve skládání - amyloidosy Alzeimerova choroba, BSE (bovinní spongiformní encefalopatie), Parkinsonova choroba ad. Jsou vyvolány akumulací proteinových agregátů v neuronech CNS. Poruchy vyvolané chyběním proteinů v důsledku chybného skládání cystická fibroza ( CFTR protein) Marfan syndrome (fibrillin), Fabryho choroba (alfa galactosidasa) 35 Chaperony •kontrolují a zabezpečují správnou prostorovou strukturu proteinů a brání vzniku nesprávných vazeb. • mnoho chaperonů patří mezi „heat shock proteins“ (hsp) •Vážou se hlavně k hydrofobních oblastem proteinů • nachází se hlavně v mitochondriích, cytoplazmě, lumen ER 36 Posttranslační modifikace proteinů Modifikace příklad Odstranění methioninového zbytku, odstranění signálního peptidu Definitivní úprava proteinu po translaci Změna délky molekuly pepsinogen®pepsin, aktivace koagulačních faktorů Glykosylace O-,N- glykoproteiny (viz dále) Acetylace Lysinové zbytky v histonech Karboxylace Gama-karboxylace glutamátu (osteokalcin, faktory krevního srážení) Methylace Lysin v histonech Prenylace proteinů zprostředkujících buněčnou proliferaci (GTP-vážící proteiny, např. Ras, Rac, Rho) Hydroxylace Prolin, lysin v kolagenu Fosforylace Proteinkinasy, často regulační role Sumoylace Stabilizace topoisomerasy II, regulace funkce traskripčních faktorů 37 Transport bílkovin do subcelulárních a extracelulárních prostorů (targeting) Syntéza proteinů na volných ribosomech Proteiny zůstávají v cytoplazmě nebo jsou transportovány do organel (jádro, mitochondrie). Obsahují sekvenci AK, která směruje jejich transport Syntéza proteinů na RER Transport do lyzosomů, ER, Golgiho komplexu nebo do membrán, sekrece z buňky 38 Transport proteinů syntetizovaných na RER-pokr. Lyzosomy Sekreční váčky Cis Golgi Trans Golgi http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/proteintrafficking/first.htm RER 39 Transport proteinů syntetizovaných na RER-pokr. • Proteiny syntetizované na RER jsou formou vesiklů transportovány do cis-části Golgiho aparátu • Zde je třídící centrum – strukturní rysy určují, kam bude protein směřován (sorting) • Některé zůstanou v Golgiho aparátu, jiné se vracejí do RER • Další putují ve formě vesiklů do trans části Golgiho aparátu • Zde se oddělují lyzosomy a sekreční váčky • Obsah sekrečních váčků je uvolněn extracelulárně • Hydrofobní proteiny zabudované v membránách váčků se stávají membránovými proteiny 40 Principy intracelulárního třídění (sorting) Příklad 1: proteiny určené pro lyzosomy jsou označeny N-vázanými oligosacharidy zakončenými mannosa-6-P Prot-oligosacharid-mannosa-6-P „adresa“ je rozpoznána specifickými membránovými receptory v Golgiho aparátu, který protein zabuduje do klathrinem pokrytého vesiklu 41 Příklad 2: Proteiny určené pro ER mají na karboxylovém konci sekvenci Lys-Asp-Glu-Leu Principy intracelulárního třídění Lys-Asp-Glu-Leu Proteiny jsou z Golgiho aparátu transportovány zpět do ER 42 Příklad posttranslační úpravy: syntéza insulinu 1 SH SH HS Odštěpení vodícího peptidu v ER Štěpení karboxypeptidasami v Golgiho aparátu preproinsulin SH Vytvoření H-můstků C-peptid Vodící peptid Mr= 11 500 23 AK 43 Výsledná struktura insulinu Na ribosomech RER se syntetizuje preproinsulin Po vstupu do RER se odstraní vodící peptid Vytvoří se dva disulfidové můstky Proinsulin putuje do Golgiho aparátu, zde začíná proteolýza a ukládání do sekrečních granul Granula putují cytoplazmou k plazmatické membráně Po stimulaci fůzují s membránou a inzulin se vylévá do extracelulárního prostoru 44 Glykosylace proteinů Glykoproteiny N-glykosidové Vazba oligosacharidu na amidovou NH2 skupinu asparaginu O-glykosidové Vazba oligosacharidu na -OH skupiny serinu nebo threoninu Liší se obsahem sacharidů a způsobem syntézy