‹#› 1 Ovlivnění katalytické aktivity enzymů Kvantifikace enzymů Ó Biochemický ústav LF MU 2012 (J.D., E.T.) ‹#› 2 Vliv pH na aktivitu enzymů pH vo pH optimum •Hodnota pH ovlivňuje ionizaci enzymu, substrátu a komplexu enzym-substrát. •Obvykle reagují pouze ionizované formy enzymu a substrátu pH nastavujeme pomocí pufrů ‹#› 3 Požadavky na dobrý pufr Faktory chemické a biochemické. Chemické faktory: Ødobrá rozpustnost ve vodě, špatná rozpustnost v org. rozpouštědlech Øne komplexace nebo srážení iontů Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+ ad. Øne reakce se složkami studovaného systému (vazba bílkovin na boritany) Øne náchylnost k bakteriální kontaminaci (glycin, citráty, fosfáty) Øne silná ionizace Øspektrální charakteristika ‹#› 4 Biochemické faktory: Øne ovlivňování aktivity enzymu Ørezistence vůči enzymové aktivitě Øne schopnost přecházet přes membrány Øne interference s oxidační fosforylací Øne reakce s kofaktory reakcí Goodovy pufry: (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/TablePage/14572938 ‹#› 5 Vliv teploty na aktivitu enzymů Se zvyšováním teploty se rychlost enzymové reakce zvyšuje až k hodnotě maxima, pak se začíná projevovat tepelná denaturace enzymu ‹#› 6 Vliv teploty na aktivitu enzymů [P] čas Se zvyšující se teplotou vzrůstá počáteční rychlost enzymové reakce, enzym je však rychleji inaktivován. Q10 - faktor udávající kolikrát se zvýší rychlost enzymové reakce, při změně teploty o 10oC (obvykle hodnota 2) Enzymy z termofilních organismů - odlišné optimální teploty. Např.Taq-polymeráza Topt.=75oC ‹#› 7 Kvantifikace enzymů ‹#› 8 Množství enzymu v biologickém materiálu lze vyjádřit dvojím způsobem Nepřímé stanovení •katalytická koncentrace •μkat/l •stanoví se produkt enzymové reakce •většina klinicky významných enzymů Přímé stanovení •hmotnostní koncentrace •μg/l •stanoví se molekula enzymu jako antigen (imunochemicky) •jen některé enzymy v extrémně nízkých koncentracích •např. tumorové markery ‹#› 9 Katalytická aktivita enzymu •zavedena jednotka katal, 1 kat = mol/s •jeden katal je katalytická aktivita enzymu, při které se v reakci přemění jeden mol substrátu za sekundu • mezinárodní jednotka IU (international unit) 1 IU = μmol/min Převodní vztahy: 1 μkat = 60 IU 1 IU = 16,6 nkat ‹#› 10 Katalytická koncentrace enzymu •aktivita je vztažena na objem biologické tekutiny (krevní sérum) •jednotky mkat/l, mkat/l …. • ‹#› 11 Stanovení katalytické aktivity •optimální podmínky (teplota, pH, pufr, kofaktory) •měří se počáteční rychlost reakce •měří se D[S] nebo D[P] v určitém časovém intervalu •kinetika 0. řádu, [S] >> Km Þ nasycený enzym, rychlost je konstantní, blíží se Vmax ‹#› 12 Dvě metody stanovení katalytické koncentrace enzymu Kinetická •průběžně se měří [S] nebo [P] •řada měření (nebo kontinuálně) •zjistí se vo z kinetické křivky •přesná metoda Konstantního času Starší metoda •měří se [P] po proběhnutí reakce •jedno měření •zjistí se průměrná rychlost D[P]/D t •méně přesná, založena na předpokladu, že reakční rychlost je konstantní ‹#› 13 Dt Dt D[P] D[P] a) b) v0 v Možnosti stanovení kvantity enzymu Metoda kinetická Metoda konst.času ‹#› 14 Závislost koncentrace na čase v enzymové reakci [P] Čas (s) Lag Počáteční rychlost Snížení rychlosti [S] Čas (s) Lag Počáteční rychlost Snížení rychlosti Bezprostředně po přidání vzorku obsahujícího enzym do reakční směsi probíhá perioda ekvilibrace, během které se enzym a substrát mísí. Tato doba se nazývá lag-fáze (s- min). Během lag fáze nelze měřit aktivitu enzymu. ‹#› 15 Příklad 1 Při enzymové reakci byl do roztoku substrátu v pufru přidán vzorek obsahující enzym (0,1 ml). Po 5 min bylo stanoveno 0,2 mmol produktu. Jaká je katalytická koncentrace enzymu ve vzorku? ‹#› 16 Příklad 1 - Řešení t = 5 min = 5. 60 s = 300 s za 300 s … vzniklo 0,2 mmol produktu za 1 s … x = 0,2/300 = 6,7 .10-4 mmol / na 0,1 ml vzorku na 1 litr vzorku = 6,7 . 10-4 . 104 = 6,7 mmol/l.s = 6,7 mkat/l ‹#› 17 Příklad 2 Reakční směs obsahovala: 2,5 ml pufru 0,2 ml roztoku koenzymu NADH (optický test) 0,1 ml krevního séra 0,2 ml roztoku substrátu Po 60 s byl pokles absorbance koenzymu DA = 0,03. e = 6220 l/mol.cm, šířka kyvety l = 1 cm. Jaká je katalytická koncentrace enzymu? ‹#› 18 Příklad 2 - Řešení Vzorek séra byl zředěn: Vkon/Vpuv = 3,0 / 0,1 = 30 Lambertův-Beerův zákon: DA = e Dc l / za urč. čas Dt Þ z toho odvodíme změnu koncentrace za 60 s: Nutno násobit zředěním: 30 . 8 .10-8 = 2,4 . 10-6 mol/l.s = 2,4 . 10-6 kat/l = 2,4 mkat/l ‹#› 19 260 Vlnová délka (nm) 340 A Absorpční spektrum oxidované a redukované formy NAD+ - princip „Warburgova optického testu“ Redukovaná forma Oxidovaná forma Oxidovaná forma NAD+ má jediné absorpční maximum při 260 nm, redukovaná forma NADH má absorpční maxima při 260 a 340 nm Měřením změn absorbance při 340 nm lze sledovat přírůstek nebo úbytek NADH Lze též měřit fluorescenci při 450 nm (pouze redukovaná forma). ‹#› 20 optický test LD Laktát + NAD Pyruvát + NADH + H při reakci klesá absorbance D A /D t Princip měření aktivity laktátdehydrogenasy LD ‹#› 21 Volba substrátů při stanovení enzymové aktivity Přírodní nebo syntetické substráty. Syntetické – často vyšší rychlost enzymové reakce. Syntetický substrát (obvykle levnější, stabilnější, dobře rozpustný, lépe definovaný...) ‹#› 22 Inhibitory a aktivátory enzymů ‹#› 23 Aktivátory enzymů Pro svou aktivitu enzymy často vyžadují přítomnost dalších látek – aktivátorů. Jsou to např. nízkomolekulární látky (meziprodukty, produkty). Řada enzymů vyžaduje přítomnost iontů – často Mg2+ ‹#› 24 Inhibice enzymů (snížení aktivity) Ireverzibilní •inhibitor pevně vázán na enzym (akt. místo) •organofosfáty •ionty těžkých kovů •kyanidy • • Reverzibilní •inhibitor volně vázán •rovnováha E+I Û E-I •inhibitor lze odstranit (dialýza, gel. filtrace) •dva základní typy: kompetitivní, nekompetitivní ‹#› 25 Kompetitivní inhibice •inhibitor je strukturně podobný substrátu •váže se do aktivního místa •soutěží s fyziologickým substrátem o vazebné místo ‹#› 26 Přirozený substrát vs. kompetitivní inhibitor Malonát je inhibitorem sukcinátdehydrogenasy ‹#› 27 Kompetitivní inhibice •maximální rychlost je dosažena až za vyšších hodnot [S] •Vmax se nemění •Km se zvyšuje ‹#› 28 Kompetitivní inhibice ‹#› 29 Nekompetitivní inhibice •Inhibitor se váže mimo aktivní centrum na E i na komplex E-S •Km se nemění (aktivní místo je volné pro substrát) •Vmax se snižuje, protože klesá koncentrace funkčního komplexu E-S ‹#› 30 Nekompetitivní inhibice ‹#› 31 Inhibitory a aktivátory při enzymových stanoveních Mohou být obsaženy ve vzorku, činidle, pufru, skle apod. Inhibovat může i produkt. Např. EDTA inaktivuje ALP protože komplexuje Zn, který je v jeho aktivním centru. Na+ slouží jako aktivátor ALP Viz též: http://www.worthingtonbiochem.com/index/manual.html ‹#› 32 Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů •Acetylsalicylová kyselina (cyklooxygenasa) •Ibuprofen (cyklooxygenasa) •Statiny (HMG-CoA reduktasa) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) •Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril) •Rev. inhibitory acetylcholinesterasy (neostigmin) – nervosvalové choroby, pooperační atonie střev •Selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterasy (rivastigmin, galantamin) - Alzheimerova choroba • ‹#› 33 Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií •Peniciliny – inhibují transpeptidasy (výstavba buněčné stěny) •Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy •Fluorované chinolony (ciprofloxacin) – inhibice bakteriální gyrasy (topoisomerasy II) (rozplétání DNA během replikace) •Sulfonamidy – blokují syntézu folátu ‹#› 34 Izoenzymy •katalyzují stejnou reakci, ale liší se primární strukturou a tedy fyz.-chem. a kinetickými vlastnostmi •mají často různou tkáňovou distribuci •stanovují se elektroforézou •izoformy – obecnější termín (zahrnují ještě pseudoizoenzymy, posttranslační varianty) • ‹#› 35 Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym Výskyt Procento celk. aktivity Zvýšení CK-MM CK-MB CK-BB svaly srdce mozek 94-96 % do 6 % stopy svalové trauma infarkt poranění mozku ‹#› 36 Allosterické enzymy jsou oligomerní •více podjednotek, často regulační a katalytická •na enzym se váže efektor strukturně odlišný od substrátu, často produkt •váže se do allosterického místa – jiné než aktivní místo •vazba vyvolá změnu konformace enzymu Þ změna aktivity - allosterická aktivace nebo inhibice • ‹#› 37 Allosterická aktivace a inhibice bez efektoru ‹#› 38 Kooperativní efekt •u oligomerních enzymů a proteinů •více podjednotek Þ více vazebných míst •odlišná kinetika •saturační graf je sigmoidní •navázání substrátu (nebo jiné látky) na jednu podjednotku indukuje změny konformace u ostatních, že se další molekuly vážou snadněji (obtížněji) • • ‹#› 39 Sigmoidní saturační graf substrát samotný substrát + alloster. inhibitor (srov. saturační křivku hemoglobinu a myoglobinu) ‹#› 40 Využití enzymů v lékařství 1.enzymy jako indikátory patologického stavu: při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině 2.enzymy jako analytická činidla v klin. biochemii 3.enzymy jako léčiva ‹#› 41 Příklady enzymů v klinické diagnostice Enzym Referenční hodnotya Interpretace zvýšení ALT CK PSA NSE do 0,9 mkat/l do 4 mkat/l do 5 μg/l do 13 μg/l hepatopatie myopatie, infarkt myokardu karcinom prostaty bronchogenní karcinom a V krevním séru, hodnoty pro muže nad 15 let ALT alaninaminotransferasa, CK kreatinkinasa, PSA prostatický specifický antigen, NSE neuron specifická enolasa ‹#› 42 Enzymy jako analytická činidla Enzym Původ enzymu Stanovení Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Aspergillus niger křen Candida sp. Pseudomonas sp. Candida sp. Myrothecium sp. bob (Canavalia sp.) Pediocus sp. glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST ‹#› 43 Enzymové stanovení glukosy glukosa + O2 ¾¾® glukonolakton + H2O2 H2O2 + H2A ¾¾® 2 H2O + A glukosaoxidasa peroxidasa bezbarvý chromogen barevný produkt (měří se absorbance) Princip stanovení glukosy v analyzátorech ‹#› 44 Pankreatické enzymy v terapii •směs enzymů (lipasy, amylasy, proteinasy) získaná z vepřových pankreatů •indikace: sekreční nedostatečnost pankreatu různé etiologie, cystická fibróza •užívání: 3 × denně při jídle •řada přípravků volně prodejných acidorezistentní tobolky, rozpadají se až v duodenu ‹#› 45 Asparaginasa v terapii leukémie •Katalyzuje hydrolýzu amidové skupiny asparaginu •Asn + H2O ® Asp + NH3 •L-asparagin je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk •Hydrolýza Asp vede k omezení proliferace •Indikace: akutní lymfoblastické leukemie • ‹#› 46 Enzymová fibrinolytika •léčiva, která rozpouštějí krevní sraženiny v cévách •streptokinasa (bakteriální), urokinasa (lidská) •štěpí plazminogen na plazmin – ten vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu •indikace: žilní trombóza, plicní embolie, akutní IM ‹#› 47 Proteasy v lokální terapii •fibrinolyzin, chymotrypsin, kolagenasa •po lokální aplikaci vedou k lýze nekrotické tkáně, nepoškozují zdravé buňky •hlavní indikace v chirurgii •hnisavé rány, bércové vředy, diabetické gangrény, dekubity, pooperační rány apod. •