1 Transkripce Ó Biochemický ústav LF MU (E.T.) 2012 2 Proces tvorby RNA na podkladu struktury DNA Je přepisován pouze jeden řetězec dvoušroubovice DNA – templátový řetězec Druhý řetězec se nazývá kódující (jeho sekvence bází odpovídá transkriptu, pouze místo U je T) Transkripce 3 5´ 3´ G G A T C 3´ 5´ C C T A G 5´ 3´ G G A U C Kódující řetězec Templátový řetězec DNA RNA Syntéza RNA probíhá opět ve směru 5´® 3´ transkripce DNA Terminologie 4 K transkripci jsou nezbytné: Dvouvláknová DNA RNA-polymerasa ATP,GTP,CTP,UTP Mg2+ ionty 5 Enzym zodpovědný za transkripci je DNA-dependentní RNA polymerasa (transkriptasa) Prokaryonty: jedna polymerasa (5 podjednotek plus sigma faktor, který se zapojuje pouze do iniciace) Přepisuje všechny formy RNA Eukaryonty čtyři různé RNA polymerasy: RNA pol I – syntéza rRNA (v jadérku) RNA pol II – syntéza mRNA (jádro) RNA pol III – syntéza tRNA, 5S RNA (jádro) RNA pol IV - syntéza mitochondriální RNA Mají stejný mechanismus účinku, rozlišují různé promotory. Většina genů u eukaryontů je přepisována RNA-polymerasou II 6 Amanitin – cyklický oktapeptid s neobvyklými aminokyselinami Inhibitor některých eukaryontních RNA polymeras (hlavně typu II) Strukt_vzorec_a-amanitin Muchomůrka zelená (Amanita phalloides) 7 Účinek RNA polymeras •Syntéza nové RNA probíhá ve směru 5´→3´ •K syntéze jsou potřebné NTP: ATP, GTP, CTP, UTP •Každý nukleotid se páruje s komplementární bází na templátovém vlákně DNA •Polymerasa tvoří fosfoesterovou vazbu mezi 3´-OH ribosy na rostoucím RNA vláknu a a-fosfátem navázaným na 5´-OH ribosy vstupujícího nukleotidu • energie polymerace je kryta štěpením NTP • neexistuje zpětná kontrola řazení bází O O C H 2 O P O O O - bá z e 1 H H O O C H 2 O O P O bá z e 2 O P O O O P O O O - - - - báze DNA RNA OH OH 8 Transkripce Tři fáze transkripce: •Iniciace •Elongace •terminace 9 Společný rys pro eukaryonty a prokaryonty: RNA polymerasy se vážou na specifické nukleotidové sekvence - promotory V místě promotoru se nachází konvenční sekvence (sekvence, které se obecně najdou v určité oblasti mnoha zkoumaných genů) Promotory u eukaryot jsou složitější než u prokaryot. Iniciace transkripce 10 Promotor u prokaryontů V pozici cca -10 obsahuje Pribnowův box TATAAT V pozici cca -35 další sekvence TTGACA Tyto sekvence jsou rozeznány s-faktorem prokaryotické RNA polymerasy Sekvence v promotoru prokaryontů -35 Pribn.box ~ 15 b Start transkripce ~ 10 b Usnadňuje lokální rozvinutí Rozpoznávací místo 11 Transkripce u prokaryontů Iniciace: Vazba RNA-polymerasy do promotorové oblasti DNA prostřednictvím sigma podjednotky Lokální rozvinutí vláken DNA účinkem RNA polymerasy Párování bází z ribonukleotidů s templátovým vláknem a tvorba fosfodiesterových vazeb mezi prvními ribonukleotidy promotor Počátek syntetizované RNA Směr pohybu RNA polymerasy Antibiotikum rifampicin inhibuje bakteriální RNA polymerasu 12 Promotor u eukaryontů (RNA polymerasa II) Transkripce eukaryontních genů je mnohem komplikovanější Je zapojena řada transkripčních faktorů (proteinů), které se vážou k různým úsekům DNA, transkripci ovlivňuje stav DNA a histonů v nukleosomech. Promotor obsahuje TATA box (Hognessův box) (sekvence TATAAAAG ve směru 5´®3´ na netemplátovém řetězci) analogický Pribnowově sekvenci (TATAAT) – určuje pravděpodobně místo startu – vazba bazálních transkripčních faktorů V pozici -100 až 200 jsou 1-2 další regulační sekvence (CAAT box, GC box) – určuje pravděpodobně frekvenci startu (promotorové proximální sekvence) Vzdálené regulační sekvence (mimo promotor) – vážou specifické transkripční faktory (proteiny) Start transkripce ~ -25 b ~ -40 b Některé sekvence v promotoru eukaryontů TATA CAAT 13 Bazální transkripční faktory jsou regulační proteiny Musí být navázány na RNA polymerasu před startem transkripce a jsou současně asociovány s promotorovými sekvencemi Samotná RNA-polymerasa nemůže zahájit transkripci Jsou nezbytné pro rozpoznání promotoru a místa startu Bazální = jsou potřebné pro transkripci všech genů Existuje řada genů, které neobsahují ani TATA ani CCAAT box – jedná se většinou o geny vyskytující se v každé buňce = housekeeping genes Jejich exprese probíhá konstatntní rychlostí 14 Bazální transkripční faktory TFIID – největší z bazálních faktorů transkripce Má celkem 11 podjednotek Jednou podjednotkou je TBP (TATA box binding protein). TBP se váže k TATA boxu, na ni nasedají další podjednotky TXIID. Po té se navazují další TF (TFIIA,B,F,E,H) a RNA polymerasa TFIIH má helikasovou aktivitu TFIIB TFIIF TFIIE TFIIA TFIIH RNA polymerasa TBP TFIID transkripce TBP Označují se TFIIX, kde X je písmeno označující konkrétní faktor 15 Genově specifické regulační proteiny Specifické transkripční faktory - proteiny, které se vážou v regulačních sekvencích mimo promotor, často velmi vzdálených. Působí jako aktivátory nebo represory transkripce příslušného genu. Specifické transkripční faktory interagují s mediátorovými proteiny (koaktivátory, korepresory), které jsou v kontaktu s bazálními transkripčními faktory. Typický gen kódující syntézu proteinu u eukaryontů má na DNA vazebná místa pro řadu specifických transkripčních faktorů 16 TF IID Pol II CTD ~ 2 000 bp Mediatorové proteiny TF IID Pol II CTD Regulační sekvence ~ 2 000 bp promotor Specifický transkripční faktor se váže ke specifické regulační sekvenci Bazální transkripční komplex (Pol II a bazální faktory) upstream Specifické transkripční faktory Interakce s mediátorovými proteiny Zapnutí/vypnutí transkripce 17 Iniciace transkripce mRNA u eukaryontů - shrnutí Transkripce je zahájena teprve po navázání všech transkripčních faktorů. Každá RNA polymerasa má své transkripční faktory. RNA polymerasa se váže k transkripčním faktorům a DNA Dvojitý helix DNA se rozvíjí a polymerasa je „sunuta“ k místu startu Většina transkripčních faktorů se oddělí. Následuje elongace. 18 Elongace a terminace RNA polymerasa se pohybuje po DNA, rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu Vznikající RNA nezůstává spojena s DNA vodíkovými můstku Hned za místem, kde byl přidán nový nukleotid dochází k obnovení dvoušroubovice a vytěsnění vlákna RNA Uvolňování RNA z templátového řetězce umožňuje vznik dalších kopií ještě před ukončením syntézy první RNA Podle jednoho genu může být současně transkribováno několik tisíc molekul RNA O terminaci u eukaryontů je známo jen velmi málo. Capping hned po uvolnění RNA – CE(capping enzyme), MT-methyltransferase 19 5´ 5´ H N N O N H 2 N N O O H O H C H 2 C H 3 + O P P P C H 2 O P O C H 2 O O C H 3 base base 5´-5´ trifosfátová vazba Tvorba čepičky u mRNA- capping Probíhá hned na počátku elongace na 5´-konci pomocí specifických enzymů. Čapka též umožňuje zahájení translace v cytoplazmě. mRNA bez čapky nemůže vstoupit do translace Navázání 7-methylguanosinu 5´-5´fosfátovou vazbou – na čapku se váže komplex proteinů, které chrání RNA před působením 5´-exonukleas a pomáhají při zavádění mRNA přes nukleární póry do cytoplazmy 20 Polyadenylace na 3‘-konci Většina eukaryontní mRNA má k 3‘-konci připojen řetězec 40-200 poly-A Je připojen posttranskripčně pomocí polyadenylátpolymerasy Mezi jednotlivými nukleotidy vznikají běžné 5‘-3‘ vazby, jako při transkripci, ale není potřeba žádný templát Poly(A) konec zvyšuje stabilitu mRNA (dokud má RNA poly(A) konec, není zpravidla degradována) a napomáhá transportu z jádra do cytoplazmy 21 Syntéza DNA - 1chyba/1010 nukleotidů Syntéza RNA – 1 chyba/104 nukleotidů RNA polymerázy nevlastní nukleolytickou korigující (proofreading) aktivitu. Toto chybění korekce (proofreading) odráží skutečnost, že transkripce nemusí být tak přesná jako DNA replikace, protože RNA není používána jako trvalá zásobní forma genetické informace. U transkripce chybí proofreeding 22 Souhrn procesů od genu k proteinu Prokaryonty Eukaryonty 23 Úpravy primárních transkriptů •Primární transkripty jsou přesnou kopií transkripční jednotky •Primární transkripty tRNA a rRNA u prokaryontů i eukaryontů jsou posttranskripčně modifikovány ribonukleasami •Prokaryontní mRNA je prakticky identická s primárním transkriptem (k translaci slouží ještě před ukončením syntézy) •Eukaryontní RNA podléhá rozsáhlým následným modifikacím – probíhají kotranskripčně 24 Úprava eukaryontní mRNA Primární transkript je hnRNA Je přepisem strukturního genu, v němž jsou kódující sekvence (exony) střídány sekvencemi nekódujícími (introny nebo intervenujícími sekvencemi) Na 5´konci je čapka (snímek 30), na 3´konci proběhne polyadenylace. Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Nekódující sekvence musí být odstraněny z primární RNA během úprav (processingu) 25 Alternativní sestřih Při typickém sestřihu jsou všechny exony primárního RNA transkriptu spojeny dohromady za vzniku mRNA pro syntézu specifického proteinu Alternativní sestřih – různé skupiny exonů z jednoho genu tvoří různé mRNA vedoucí k syntéze různých proteinů Exon 1 Exon 4 Exon 3 Exon 2 Primární transkript Alternativní sestřih Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 2 Exon 4 Protein A Protein B