Principy vyšetření hemostázy, preanalýza
FN BRNO
Dělení testů dle principu
*Koagulační
Fotometrické ^Imunochemické
-_s Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické)
Sledování času rozpuštění koagula * Sledování rozpustnosti koagula Jiné
Dělení testů dle principu
Koagulační
_i sledování času srážení
manuálně (kývání, rotace)
aktivovaná doba srážení
^ sledování času vytvoření fibrinového vlákna manuálně (háčkování) koagulometr (poloautomat, automať
mechanické
• kuličkové (sledování změn pohybu kuličky)
• háčkové optické
• nefelometrie (sledování rozptylu světla)
• turbidimetrie (sledování průchodnosti světla)
Dělení testů dle principu
* Fotometrické
^ sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A)
• end point" (A)
• kinetické (AA/min)
i] limitace -hemolytické a ikterické vzorky Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické)
ilj sledování změn zakalení
• detekce změn transmise (propustnosti T)
• detekce změn absorbance ^ limitace-chylózní vzorky
Kinetické měření
Dělení testů dle principu
Imunochemické
^ sledování reakce antigénu s protilátkou aglutinace
• LIA
• ELISA jEID
Aglutinační metody
sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
* odečítání makroskopicky
^ pozitivní( +, ++, +++)/negativní ^ semikvantitativní metody (udaná mez detekce)
metody
^ latexaglutinační (např. FDP, D-Di) ^ hemaglutinační (např. FM)
Příklad vyšetření D-Dimerů
Mez detekce = 0,5 mg/l	neředěný vzorek	vzorek ředěný 1:6	výsledek
aglutinace			< 0,5 mg/l
aglutinace	+		> 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l
aglutinace	+	+	> 3,0 mg/l
Liquid immunoassay - LIA metody
Sledování aglutinace mikrolatexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu
Odečítání optickým systémem koagulometru
*j Změna zakalení (AA/min)
* Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...)
* Limitace
^ Chylozita vzorku
^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem)
LIA testy
Provedení (STA© Liatest© D-Dimer)
50 uJ vzorku
100 \l\ pufru
inkubace 240 s
150 ml
latexového měříme činidla změnu ^ absorbance mezi 12S-140S
LIA testy
Kalibrace
^ Sigmoidní ^ Křivka 3. řádu
^ Minimálně 5 bodu
^ Platí pro celou šarži
ELISA metody
Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní
inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab
*j odsátí vzorku + promytí
^ inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag
^ odsátí AbE a promytí
^ detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag ■ AbE po přídavku chromogenního substrátu (A)
j přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag
Elektroimunodifúze - EID metody
* vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku
Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu
kvantitativní metoda
Princip EID
kalibrace      vzorky pacientů
Vyšetření plazmatických proteinů
Vyšetření funkční aktivity ^ koagulační metody ^ fotometrické metody
Vyšetření antigénu
^ imunochemické metody
j umožňují odlišení defektů :valitativních ) kvantitativních
Dělení testů
Testy globální
^ postihují celý systém (i více) Testy skupinové (screenini ^ postihují určitou část koagulačního systému
^ umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu
Testy speciální ^ vyšetřují jednotlivé složky systémů
Správnost laboratorních výsledků
Faktory ^ objektivní ^ subjektivní Faktory ^ preanalytické ^ analytické ^ postanalytické
Preanalytické faktory
Příprava pacienta ^ Odběr vzorku
* Transport vzorku
* Zpracování vzorku
* Skladování vzorku
Příprava pacienta
^Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru
* Uvedení léčby
* Uvedení komolikace oři odběru
Odběr vzorku
* Minimální zatažení paže
*Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek
^ První 2-3 ml nelze použít
■^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10
* Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox)
Nedostatečné promíchání krve s citrátem
Nebezpečí aktivace a srážení vzorku * Koncentrování citrátu u hladiny
^ automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu ^ špatné výsledky
^ ověření po stažení plazmy a promíchání
Antikoagulancia
Citrát sodný 5j 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno 5j 1,129 mol/l (3,8%)
*CTAD zkumavky
^ brání aktivaci trombocytů
Správný odběr vzorku
Vyřadit vzorky * Sražené S chybným objemem krve (rozdíl 10%)
Hemolytické, ikterické a chylózní
^ hemolytický a ikterický vzorek
• ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení
chylózní vzorek
j ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky
Správný odběr vzorku
Hematokrit 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu
100 - hematokrit
ml citrátu = ------------------x ml plné krve
595 - hematokrit
Transport vzorku
*Čas * Teplota Mechanické vlivy (potrubní pošta)
Zpracování vzorku
* Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy
Většina testů do 1 -2 hod po odběru
* Výjimka EGT, EF (15-30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření fcí trombocytů
Vyšetřovaný materiál
Plazma
*y plazma bohatá na trombocyty
j centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace
*y plazma chudá na trombocyty j centrifugace 15 minut 2500 g
^ bezdestičková plazma
dvojnásobná centrifugace + filtrace
Plná kn Sérum
Centrifugace
-v
Výpočet otáček pro danou centrifugu g = 1,118x10"5xrxN2
r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min
Příklad:
r = 15 cm, 2500g    3860 otáček/min
Skladování vzorků
Laboratorní teplota 18-25 °C a PT 8 hodin ^ APTT 4 hodiny
^ APTT (léčba heparinem) 2 hodiny ^ jednotlivé faktory : 2 - 8 hod
Vyšší teplota ne
Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII)
Zamrazování vzorků
Plazma chudá na destičky/bezdestičková Objem > 500 mI Zkumavka se zátkou
* Správná velikost zkumavky
* Zkumavka naplněná do 3/4 Rychlé zamrazení (-70 °c, -196 °C)
■^Sskladování zamrazených vzorků
^ krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 "C
Rozmrazování vzorků
*Při 37 °C 15 minut
^ Dobře promíchat
* Opakované zamrazení není možné
Analytické faktory
Dodržování metodických postupů
* Správné pracovní návyky
Správná funkce a kalibrace přístrojů
Výběr diagnostických setů a reagencií
Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů
Správně provedená kalibrace a kontroly kvality
Postanalytické faktory
Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí
* Vyjadřování výsledků
* Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků