ApoptózaApoptóza –– význam a regulacevýznam a regulace u nádorové buňkyu nádorové buňky RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. 23.3.2012 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Brno  Které molekuly zapojené v regulaci apoptózy jsou nejslibnějším cílem protinádorové terapie a proč? Hyršlová Vaculová A., 2012 Apoptóza a její význam  Geneticky kontrolovaný proces cílené sebedestrukce buňky  Eliminace nepotřebných, poškozených, nebezpečných, mutovaných či jinak pozměněných buněk za účelem udržení homeostázy mnohobuněčného organismu Hyršlová Vaculová A., 2012 Morfologie – nekróza vs. apoptóza  ztráta integrity plazmatické membrány  bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky  rozbití jádra  desintegrace buněčných organel  kompletní lyze buňky  bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena  zmenšení velikosti buňky  kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu  udržení integrity intracelulárních organel  formace tzv. apoptotických bodies Hyršlová Vaculová A., 2012 Necrosis Apoptosis a b c d http://spsscience.blogspot.com/2010/11/cell-even-die.html http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/rese arch/cytotech/apopto/data/chap10.htm Hyršlová Vaculová A., 2012 (Taylor RC, Cullen P, Martin SJ, 2008) Apoptosis Hyršlová Vaculová A., 2012 Nekróza versus apoptóza  Postihuje skupiny buněk  Indukována nefyziologickými stimuly  Poškození okolní tkáně – vylití toxických látek  Spouští zánět  Týká se jednotlivých buněk  Indukována fyziologickými stimuly  Fagocytóza makrofágy  Není zánět Hyršlová Vaculová A., 2012 CrucialCrucial importanceimportance ofof balancebalance betweenbetween cellcell proliferationproliferation andand deathdeath Pathological cell accumulation •Pathological cell loss homeostasis ApoptosisProliferation (Zhivotovsky et al) - deregulations… serious consequences…. Hyršlová Vaculová A., 2012 Cell death research field (Melino, Vaux, 2010) PubMed – papers: Apoptosis - 220405 Apoptosis and cancer - 91617 Apoptóza a nádorová onemocnění  Nádorová onemocnění – nejvíce zkoumaný typ onemocnění v souvislosti s defekty apoptózy  Charakteristický znak nádorových buněk deregulace apoptózy – omezení spontánní apoptózy, rezistence k působení induktorů apoptózy („chybný apoptotický program“)  Strategie protinádorová terapie - cílené spuštění apoptózy, eliminace nádorových buněk, bez poškození okolní zdravé tkáně organismu Hyršlová Vaculová A., 2012 Hlavní problémy současné protinádorové terapie: – Omezená selektivita, výrazné poškození zdravých tkání organismu – Rezistence nádorových buněk Hyršlová Vaculová A., 2012 Apoptóza  Aktivace specifických molekul – kaspázy, nukleázy…  Nutné dodání energie ve formě ATP  Specifická fragmentace jaderné DNA  Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií  Změny symetrie membrán Hyršlová Vaculová A., 2012 Specifické proteiny v regulaci apoptózy  Kaspázy  Inhibitory kaspáz  Proteiny rodiny Bcl-2  Mediátory apoptózy uvolňované z mitochondrií Hyršlová Vaculová A., 2012 Kaspázy - cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazmě - štěpením vzniká aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty“ a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy Hyršlová Vaculová A., 2012 (Vaculova et al., 2008) Kaspázy – klíčové regulátory apoptózy „death substrates“ PIDDosome apoptosome DISC Hyršlová Vaculová A., 2012 Iniciační versus efektorové kaspázy  Dlouhá prodoména  Monomery inaktivní  Aktivace na úrovni multiproteinových komplexů  Autokatalytické štěpení  Krátká prodoména  Dimery inaktivní  Aktivace přímým štěpením iniciačními kaspázami  Není autokatalytické štěpení Hyršlová Vaculová A., 2012 Štěpení/aktivace kaspáz Proteolytické štěpení v mistech mezi malou a velkou katalytickou podjednotkou (Asp) Aktivní kaspáza - heterotetramer ze dvou heterodimerů odvozených ze dvou původních molekul (Lavrik et al., 2010) Hyršlová Vaculová A., 2012 (Lavrik et al., 2005)Dělení kaspáz Hyršlová Vaculová A., 2012 Proteolytic activity of caspases is crucial prerequisity for apoptotic phenotype  Degradation of structural proteins – cytoskelet (e.g. keratins) and nucleus (e.g. nuclear lamins) – Plasma membrane blebbing and nuclear condensation  Exposure of phosphatidyl serine at the cell surface – Important „eat me“ signal for phagocytes  Cleavage of negative regulators of apoptosis and disabling their function (caspase inhibitors, antiapoptotic Bcl-2 family proteins..)  Activation of important apoptotic players by cleavage (Bid, effector caspases…)  Cleavage of proteins involved in regulation of DNA synthesis, repair, degradation (ATM, ICAD, PARP, polymerases…)  And many others… Hyršlová Vaculová A., 2012 Kaspázy a nádorové onemocnění Deregulace na úrovni kaspáz u nádorových buněk - absence příslušné kaspázy (methylace promotoru atd.) - mutace kaspáz, nefunkční - inaktivace v důsledku upregulace přirozených inhibitorů - bloky v „upstream“ signálních drahách Hyršlová Vaculová A., 2012 Dvě hlavní dráhy indukce apoptózy  Vnitřní – „intrinsic pathway“ - „mitochondrial pathway“, spouští se uvnitř buňky, klíčová úloha mitochondrií a iniciační kaspázy-9 (-2)  Vnější – „extrinsic pathway“ - „death receptor pathway“, začíná u povrchových receptorů smrti, klíčová role iniciační kaspázy-8 (-10)  Centrální molekuly obou drah – kaspázy – obě dráhy se „sbíhají“ na úrovni efektorových kaspáz, které dále štěpí specifické substráty v buňce a umožní tak průběh exekuční fáze apoptózy  Možná interakce obou drah na různých úrovních v buňce, „cross-talk“ Hyršlová Vaculová A., 2012 (Calvino-Fernández et al., 2010) Dvě hlavní dráhy aktivace kaspáz a spuštění apoptózy Bcl-2 family proteins Hyršlová Vaculová A., 2012 Endogenní inhibitory kaspáz  IAPs – „inhibitor of apoptosis proteins“  cIAP1, cIAP2, XIAP, survivin – váží se na prokaspázy a kaspázy a blokují jejich aktivitu, mohou inhibovat jak iniciační, tak efektorové kaspázy – různé mechanismy Hyršlová Vaculová A., 2012 Mammalian IAPs (Riedl, Shi, 2004) Hyršlová Vaculová A., 2012 Regulace IAPs  transkripční  translační  Posttranslační (ubiquitinylace)  Interakce s jinými proteiny (Smac/DIABLO, Omi/Htra)  Selektivní downregulace IAP: – Anti-sense oligonucleotidy – Smac mimetics Hyršlová Vaculová A., 2012 Deregulace of IAPs  IAPs – proteiny efektivně modulující aktivitu iniciačních i efektorových kaspáz, vnější i vnitřní dráhy  Vážné důsledky deregulací  Overexprese u řady typů nádorů (inhibice apoptózy) – Významná úloha v regulaci vývoje nádorového onemocnění a citlivosti nádorových buněk k terapii – Látky schopné inhibice IAPs – slibná protinádorová terapeutika Hyršlová Vaculová A., 2012 IAP antagonists in clinical trials for cancer treatment  More than 50 patents have been filled during the last ten years aimed in blocking IAP function and stimulate apoptosis  Trigger autoubiquitinylation and proteasomal degradation of IAPs (Gyrt-Hansen, Meier 2010) Hyršlová Vaculová A., 2012 Vnitřní dráha indukce apoptózy  Konvenční radioterapie a chemoterapie – spuštění vnitřní dráhy indukce apoptózy (poškození DNA, aktivace p53 – závislá na p53, aktivace kaspáz a mitochondrií…) – neselektivně u nádorových i normálních buněk, časté a četné vedlejší účinky Příklady chemoterapeutických látek: - cisplatina, oxaliplatina, etoposid, doxorubicin, 5-fluorouracil atd. Hyršlová Vaculová A., 2012 http://biophysics.bumc.bu.edu/akey/images/projects/intrinsic-apoptotic-pathway.jpg Vnitřní dráha Hyršlová Vaculová A., 2012 Mitochondrie a apoptóza  Důležitá úloha mitochondrií v regulaci apoptózy  Klíčové regulátory v mitochondriích proteiny rodiny Bcl-2  Změny na úrovni mitochondriální membrány – membránový potenciál, tvorba pórů, produkce ROS  Uvolnění proapoptotických proteinů z mitochondrií – cytochrom c, AIF, endoG, Smac/DIABLO, Omi Hyršlová Vaculová A., 2012 Proteiny rodiny Bcl-2  Důležité regulátory apoptózy na úrovni mitochondrií  Rodina asi 30 proteinů, pro něž je charakteristická přítomnost tzv. domény BH (Bcl-2 homology), které zprostředkovávají interakce s jejich vazebnými partnery  Patří sem proteiny jak s proapoptotickou, tak antiapoptotickou funkcí, na jejich rovnováze pak závisí osud buňky Hyršlová Vaculová A., 2012 Bcl-2 family classification  Antiapoptotic multidomain • Bcl-2 homology domains BH1-4 • OMM, cytosol, membrána ER • Přímo se váží s proapoptotickými členy rodiny Bcl-2 a chrání integritu OMM • Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1  Proapoptotic effector • Indukují MOMP a vylití apoptotických mediátorů z mitochondrií • Bax, Bak, (Bok)  Proapoptotic BH3-only – Bid, Bim, Noxa, Puma, Bmf… Hyršlová Vaculová A., 2012 Proteiny rodiny Bcl-2 Regulace mitochondriální dráhy indukce apoptózy Antiapoptotic multidomain Bcl-2 family proteins  Blokace mitochondriální dráhy indukce apoptózy  Interakce s proapoptotickými členy rodiny Bcl-2 a jejich inhibice  Časté overexprese u řady typů nádorů (hlavně proteiny Bcl-2 a Mcl-1) – Nádory pak rezistentní ke konvenčně používané chemoterapii Hyršlová Vaculová A., 2012 „Proapoptotic Bcl-2 family effectors“  Přímá aktivní úloha v aktivaci mitochondriální dráhy apoptózy  Stimulace změn v mitochondriální membráně, které vedou k uvolnění proapoptotických mediátorů, formace pórů  Interakce s antiapoptotickými proteiny rodiny Bcl-2  Absence nebo inaktivace u některých typů nádorů Hyršlová Vaculová A., 2012 BH3-only proteins  Aktivovány působením stresu různého druhu  Účast v řadě signálních drah  „Signal-specific activation“  Transkripční nebo posttranslační aktivace  Stimulace apoptózy v přítomnosti proteinů Bax nebo Bak Hyršlová Vaculová A., 2012 BH3 only proteins classification  Sensitizers/derepressors • Bind only antiapoptotic Bcl-2 family members • Bad, Noxa, Puma, Bik, BMF, HRK  Direct activators • Interact with both antiapoptotic and proapoptotic Bcl-2 family proteins • Can directly activate Bax or Bak and induce MOMP (induce Bax/Bak oligomerization and pore-forming activity) • Bid, Bim, (Bok) (Tait et al., 2010) Hyršlová Vaculová A., 2012 BH3 only proteiny a nádorová onemocnění  Chrání buňky před maligní transformací  látky napodobující jejich působení jsou využitelné jako slibná strategie pro posílení účinnosti protinádorové terapie  BH3 mimetics – Malé molekuly, které jsou strukturně a funkčně podobné BH3 only proteinům – Selectivně specifické pro konkrétní antiapoptotické proteiny – Ve fázi klinického a preklinického testování Hyršlová Vaculová A., 2012 BH3 mimetics  ABT-737 – One of the most advanced and best-characterized BH3 mimetics – Predominately binds to Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w – Effective inductor of cell death, especially in tumour cells overexpressing Bcl-2, but only in the reesence of Bax or Bak – Can cooperate with conventional chemo- and radiotherapy in many hematological malignancies and solid tumor  ABT-263 – Orally available derivative of ABT-737 – Antitumor properties in multiple models – In clinical trials for lymphocytic leukemia, lymphoma, SCLC  Gossypol (AT-101) – Natural phenolic compound found in cotton plants – Inhibits Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 – In clinical trials for prostate cancer, lymphocytic leukemia, SCLC Hyršlová Vaculová A., 2012 Bcl-2 BaxBcl-XL Mcl-1 Bak Bad Bid Death blocker Death inducer Cell death signal CHECKPOINT Death signal blocked Death signal promoted CELL SURVIVAL CELL DEATH Hyršlová Vaculová A., 2012 (Chonghaile et al., 2009) Bcl-2 family and cancer Hyršlová Vaculová A., 2012 Mediátory apoptózy uvolňované z mitochondrií  Cytochrom c – aktivace kaspázy-9 na úrovni apoptozomu  Smac/DIABLO – inhibuje IAPs – přispívá tak k aktivaci kaspáz  EndoG – mitochondriální nukleáza, translokuje se do jádra, kde štěpí DNA  Omi/Htra – serinová proteáza, antagonista některých IAPs  AIF – translokován do jádra, iniciace řady procesů apoptózy včetně např. kondenzace chromatinu Hyršlová Vaculová A., 2012 (Jin, Reed, 2002) Mechanismus působení Smac/DIABLO a Omi/Htra2 Hyršlová Vaculová A., 2012 Smac/DIABLO  Smac: second mitochondria-derived activator of caspases (first was cytochrom c)  DIABLO: Direct Inhibitor of Apoptosis-Binding protein with LOw pI)  Po působení apoptotického stimulu je uvolňován z mitochondrií a spouší apoptotické signálování  inhibuje cIAPs (XIAP, cIAP1/2)  Posílení exprese Smac vede ke zvýšené citlivosti nádorových buněk k apoptóze  Vývoj peptidů a malých syntetických molekul, které napodobují funkce Smac v buňce a podporují indukci apoptózy – Eliminace nádorových buněk, jejich zcitlivění k účinkům protinádorové terapie Hyršlová Vaculová A., 2012 Cytochrome c  The role of cytochrome c in apoptosis was first described when addition of dATP to cytosolic extracts induced caspase activity (Liu et al., 1996)  Microinjection of cytochrome c into cytoplasm of mammalian cells induces apoptosis  Cytochrome c –deficient cells were resistant to many apoptotic stimuli, and showed decreased caspase-3 activation  In mitochondrial membrane cytochrome c is associated with cardiolipin, oxidation of cardiolipin disrupts the interactions, which leads to cytochrome c release (Yong-Ling et al., 2008) Hyršlová Vaculová A., 2012 Apoptozom (Tait et al., 2010) - Multiproteinový komplex složený z cytochromu c, Apaf-1, ATP, kaspázy-9 - slouží jako platforma pro aktivaci kaspázy-9 - funkce závisí na dodání energie (ATP) Hyršlová Vaculová A., 2012 http://biophysics.bumc.bu.edu/akey/images/projects/intrinsic-apoptotic-pathway.jpg Vnitřní dráha Hyršlová Vaculová A., 2012 Vnější dráha indukce apoptózy  Novější přístupy – spuštění vnější dráhy indukce apoptózy, specificky přes povrchové receptory, výhody: – nezávislost na p53 - vyšší selektivita - nižší vedlejší účinky Více než 50% nádorů – mutace p53, pro tyto nádory se jeví indukce apoptózy přes povrchové receptory velmi slibnou, výborná alternativa ke konvenčním terapeutickým přístupům Hyršlová Vaculová A., 2012 Apoptóza zprostředkovaná přes povrchové receptory smrti  Tzv. „death receptory“ – receptory smrti, přes ně dochází ke spuštění apoptózy indukované tzv. ligandy smrti – „death ligands“  Patří do rodiny TNF (tumor necrosis factor)  Obsahují tzv. „death doménu“, která umožní pokračování přenosu apoptotického signálu (vazba s dalšími členy signální dráhy) Hyršlová Vaculová A., 2012 Aplikace TRAILu – atraktivní cílený přístup v protinádorové terapii Výhodné vlastnosti – selektivita pro nádorové buňky, nízká toxicita pro zdravé buňky organismu, ale: Poslední dobou se ukazuje, že řada nádorových buněk je rezistentní k apoptóze indukované TRAILem popis signálních drah TRAILu je proto velmi důležitý pro pochopení mechanismu působení, mechanismů rezistence a pro správné zacílení protinádorové terapie Hyršlová Vaculová A., 2012 Effector caspases caspase-8 caspase-9 caspase-3 Pro-caspase-9 dATP Apaf-1 Cytochrom c Pro-caspase-8 (Pro-caspase-10) Bid tBid Mitochondria Cell membrane FADD TRAIL „death receptor“ Mcl-1 Bcl-xL Bcl-2 Bax Bak nucleus DISC FLIP „Death“ substrates Type I cells Type II cells TRAIL-induced apoptotic signaling Hyršlová Vaculová A., 2012 Kaspáza-8  Naprosto klíčová molekula v přenosu apoptotického signálu TRAILu z receptorů do nitra buňky  Po vazbě TRAILu na DRs dochází k tvorbě DISCu, vazbě pro-kaspázy-8 do DISCu (přes protein FADD) a její aktivaci  Iniciační kaspáza, aktivovaná ve dvou krocích, autokatalytické štěpení  Kompetitivně inhibovaná pomocí cFLIP  Množství aktivované kaspázy-8 je klíčové pro další osud buňky – Hodně aktivní kaspázy-8 – přímé štěpení kaspázy-3 a exekuce apoptózy (buňky typu I) – Málo aktivní kaspázy-8 – nutná amplifikace apoptotického signálu přes mitochondrie, kaspáza-8 štěpí protien Bid, ten translokován do mitochondrií, spuštění dráhy (buňky typu II) Hyršlová Vaculová A., 2012 Specifické štěpení kaspázy-8 dva hlavní kroky (Lavrik et al., 2005) Hyršlová Vaculová A., 2012 TRAIL DR4/5 cFLIP a nádory  U řady typů nádorů je zvýšená exprese proteinu cFLIP  Rezistence k apoptóze zprostředkované přes povrchové receptory  Modulace anti-apoptotického signálování (NF-κB, Akt/PKB, MAPK) Hyršlová Vaculová A., 2012 V řadě případů se ukazuje, že monoterapie využívající TRAIL je nedostačující – velká šance ve využití kombinované terapie – TRAIL + chemoterapeutické látky Hyršlová Vaculová A., 2012 Kombinovaná terapie http://www.helmholtz-muenchen.de/typo3temp/pics/d6439b2eea.gif Hyršlová Vaculová A., 2012 Kombinovaná terapie  TRAIL + chemoterapie/radioterapie  Chemoterapeutické látky zvyšují citlivost nádorových buněk k apoptóze indukované TRAILem – Pomocí různých molekulárních mechanismů – Na různých úrovních signální dráhy TRAILu – S ohledem na typ použitého chemoterapeutika (koncentrace, aplikační schema atd.) – S ohledem na typ léčeného nádoru, typ buněk – S ohledem na typ rezistence buněk atd. (type I, II) Hyršlová Vaculová A., 2012 (Calvino-Fernández et al., 2010) Two main routes of caspase activation and apoptosis triggering Bcl-2 family proteins Hyršlová Vaculová A., 2012 Kontrola aktivace kaspáy probíhá na několika úrovních  cFLIP  cIAPs – XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin  inhibitors of IAPs – – Smac/DIABLO, Omi/Htra  Bcl-2 family proteins – proapoptotic – Bid, Bax, Bak, Bim, Bad – antiapoptotic – Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 Hyršlová Vaculová A., 2012  Které molekuly zapojené v regulaci apoptózy jsou nejslibnějším cílem protinádorové terapie a proč? Hyršlová Vaculová A., 2012 (Calvino-Fernández et al., 2010) cIAPs Smac/DIABLO cFLIP antiapoptotic Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Mcl-1) proapoptotic Bcl-2 family proteins (Bax, Bak) death receptors Multiple control of caspase activation Hyršlová Vaculová A., 2012 Deregulation of apoptosis in cancer cells  Typical characteristics of cancer cells – deregulation of apoptosis, „wrong apoptotic program“ – suppression of spontaneous apoptosis • survival advantage of tumour – resistance to the effects of apoptosis inductors  Goal of anticancer therapy – selective elimination of cancer cells by reactivation of apoptotic program, – without any harm to normal surrouding tissue Search for and testing agents with the ability to effectively trigger apoptosis signaling pathways in cancer cells Hyršlová Vaculová A., 2012 cIAPs Smac/DIABLO cFLIP antiapoptotic Bcl-2 family proteins proapoptotic Bcl-2 family proteins death receptors BH3 mimetics Antisense oligonucleotides (Bcl-2, Mcl-1) Smac mimetics XIAP antisense IAP inhibitors DR activation and/or upregulation Caspase reactivation/reexpression Strategies for apoptosis trigering in cancer cells cFLIP antisense Main goals of anticancer research  Reactivation of apoptotic program in cancer cells resistant to killing  Identification of the specific blocks in apoptosis pathways in cancer cells  Selective targeting of cancer cells at the level of the specific signaling molecules  Testing killing efficiency of novel and conventionally used chemotherapeutic drugs  Increase effectiveness of therapy by combination of anticancer drugs (as monotherapy is often insufficient) Hyršlová Vaculová A., 2012  Které molekuly zapojené v regulaci apoptózy jsou nejslibnějším cílem protinádorové terapie a proč? Hyršlová Vaculová A., 2012 Mechanismy buněčné smrti, význam, metody Bi8870 RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. … vždy v jarním semestru, 2 hodiny týdně Hyršlová Vaculová A., 2012 Děkuji za pozornost! Vaše případné dotazy směřujte na adresu: vaculova@ibp.cz Hyršlová Vaculová A., 2012