Doporučená literatura Vašků A., Izakovičová Holld L., Gaillyová R.: Genetika v zubním lékařství (http://www.med.muni.cz/patfyz/) Nussbaum R.L., Mclnnes R.R., Willard H.F.: Klinická genetika. 2004. v Šmarda J. a kol.: Metody molekulární biologie. Brno, 2005 Požadavky na ukončení předmětu Aktivní účast na cvičení Protokol 60% úspěšnost v testu Obsah cvičení Teoretická část 1. cvičení - význam DNA diagnostiky v patogenezi parodontitidy 2. cvičení - molekulárně genetické metody Praktická část • Detekce polymorf ismu v genu pro interleukin-1 1. cvičení - polymerázová řetězová reakce a reštrikční štěpení 2. cvičení - elektroforéza na agarózovém gelu destruktivní postihující podpůrné tkáně zubů (ztráta závěsného aparátu, alveolárni kosti, zubů) multifaktoriální choroba - faktory exogénni i endogenní .Environmental bacteria factor Severity of Periodontitis mikrobiální povlak - anaerobní G~ bakterie (P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. forsyfhia. T. de nti co la, P. in fermedia o poškození parodonotu způsobeno: (např. toxiny, enzymy, LPS,...) (např. prozánětlivý TNFa, n am Gingival — epithelium Pathogenic dental-plaque | biofilm Bone loss Nature Reviews I Microbiolog Parodontitida Kandidátní geny • Geny pro imunoregulační faktory - interleukiny (IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL- 18 a další) • Metaloproteinasy (MMP1, MMP3, MMP9, MMP12 a další) • Produkty kostní remodelace (VĎR, RASE, S FTP Ď a další) Cytokiny • široká škála signálních peptidu, některé mají i hormonální účinky • slouží ke komunikaci nejen leu, ale i b. kostní dřeně endotelu a dalších...řídí proliferaci, diferenciaci a funkci buněk IS • podílí na procesech zánětu a na neuronálním, krvetvorném a embryonálním vývoji organismu • nejsou uloženy v žlázách (oproti hormonům), jsou rychle syntetizované a vylučované různými buňkami většinou po stimulaci • jsou pleiotropní • působení jiných cytokinů aditivním, synergickým nebo protichůdným způsobem JY (\ prozánětlivý mcdiátor - cytokin uvolňován monocyty, makrofágy, fibroblasty a dendritickými buňkami stimuluje r;esorpci, kosti a reguluje Drolifej^aci f ibroblastu gingivá ního i ligamentálního původu hladiny IL-la a IL-lĎ (prozánětlivé cytokiny) a poměr IL-1 s antagonistou IL-receptoru (protizánetlivý cytokin) -| u chorob parodontálnícn tkání na chromozomu 2ql3-q21 recesivní alely IL-1A -889 a IL-1B +3953 - 1 genové transkripce a produkce proteinu (t prozáněthvá odpověd) recesivní alely IL-1RN VNTR -J, genové transkripce. Komerčne dostupné testy testují přítomnost: • mikrobiálních patogenů • specif, s parodontitidou asociovaného IL-1 genotypu GenoType PST® test od GenoType™ PST test HAIN Diagnostics ™ od Ďentalyse™ Praktické cvičení Izolace DNA Polymerázová řetězová reakce (PCR) Reštrikční analýza Elektrof oréza (ELFO) na agarózovém gelu Izolace DNA Vstupní materiál periferní krev (leu) buňky bukální sliznice (sliny, stery) amniové buňky choriové klky buňky vlasových kořínků spermie epiteliální buňky pokožky uvolněné buňky v tělních sekretech Odběry bukální stery - na kartáček, nechat vysušit 3 dny (kvasinky) sliny - 10 ml, hodinu před odběrem nejíst a nekouřit, skladovat 1-3 dny při teplotě 4°C periferní krev - odběr do chelatacního roztoku EĎTA (zabránění srážení krve a degradaci ĎNA Ďnázami), skladovat 1-5 dní při teplotě 4°C, nebo dlouhodobě v zamraženém stavu Izolace DNA Metody izolace DNA metody využívající rozdílnou rozpustnost biologického materiálu - fenol-chloroformová extrakce - ethanolová (isopropanolová) precipitace adsorpce na pevný podklad - vazba NK na křemičité sklo (silikát) v přítomnosti chaotropních solí (Nal, guanidin thiokyanát, guanidin hydrochlorid) - iontová síla, typ NA a pH • vysolování - lýza ery NH4CI, b. membr. - proteináza K, lýza jad. membr. a precipitace proteinů - NaCI, ethanol - vysrážení NA • v hustotním gradientu - gradient CsCI LOW Caa density Genomic DNA Nicked circular DNA OOOOOO Huparcoiled DNA RNA Izolace DNA Princip lyže buněk (rozrušení buněčných membrán) - tenzidy, lysozym, změna osmotického tlaku, změna pH, změna t odstranění membránových lipidů a proteinů chemicky (detergenty) - chemicky (např. hydrolýzou bílkovin pomocí proteolytických enzymů ...proteináza K, jejich denaturací apod.) - vysol ování (precipitace proteinů -NaCI) fyzikálně (na základě různé afinity ĎNA a kontaminantů k různým látkám...fenol -chloroformová extrakce) odstranění RNA - přec iŠťovací enzymy (RNAázy) precipitace DNA - ethanol (isopropanol) purifikace DNA - 70% ethanol rozpuštění DNA - pufr (slabě alkalický) SCIENCEphotOLIBRARY Izolace DNA Fenol-chloroformová extrakce DNA "V precipi- x £p|tatesat W interface v Lyse cell with lyso-zyme oř detergent IP Cell suspension Alcohol layer Insert glass rod and gently twirl Pick up DNA strands on glass rod Lysed cells with DNA in solution Cell debris Aqueous solution of DNA Čistota a koncentrace ĎNA spektrofotometricky (např. na přístroji NanoĎrop) NA absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm, zatímco proteiny v oblasti okolo 280 nm stupeň Čistoty NA se stanovuje z poměru absorbance pri 260 a 280 nm (ideální poměr 260/280 = 1,8) popsal v r. 1983 Kary B. Mullis, 1993 NP princip: enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplofních fázích (denaturace, annealing, extenze) výsledek: počet kopií dané sekvence DNA- 2n(n-počet cyklů) komponenty reakční směsi pro PCR: - voda - pufr - dNTP (dATP+dTTP+dCTP+d6T) - MgCI2 - termostabilní DNA polymeráza (např. Taq z bakterie Thermus aquaficus) - oligonukleotidové sondy ("primery") - specifická Ta - templátová DNA PCR teplotní režim (v termocycleru): 1) 95°C 2* iniciální denaturace 2) 96°C 30"dcnaturacc 3) 40-72°C 20M annealing 4) 72°C 30" elongace • kroky 2-4 celkem 30x 5) 72°C 5' závěrečná elongace 6) 4°C 10' zchlazení hŤŤp7/www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKUAfeatu re=related WlAäM PCR Modifikace • Reverzně transkripční PCR • Alelově specifická PCR • PCR RFLP • PCR VNTR • Real-time PCR • Nested PCR - nejprve amplif ikace genomické DNA - v další PCR reakci je templátem produkt reakce VII/.// 1 1 předcházející - zvyšovaní specif ity • Multiplex PCR - detekce několika genů součastně v jedné reakci - př. detekce deletovaných exonů u Ďuschenovy muskulární dystrofie PCR Reverzně transkripční PCR • amplifikace RNA • RNA-dependentní ĎNA-polymeráza • eliminace intronů - poskytuje informace o alternativním sestřihu • analýza genové exprese (detekce infekčních agens, genetických chorob) Alelově specifická PCR • ve dvou nebo více paralelních reakcích • detekce SNP analýza DNA pomocí specifického štěpení restrikčními endonukleázami (RE) enzymy bakterií vyvinuté během evoluce k štěpení cizí DNA ndzev odvozen dle jejich původce - např. EcoRI (Exoli) rozpoznávací specif. oblast (palindrom) 5 -CCT G^AATTC AGG-3 3 -GGA CTTAAWG TCC-5 štěpí vnitřní fosfodiesterové vazby schopny rozpoznat a štěpit JEN specifické sekvence (zamezení bakt. narušení vlastní DNA) mají specifickou teplotu, při které štěpení probíhá optimálně využití - při detekci určité mutace (SNP) PCR VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) - minisatelitní sekvence, introny genů a mezigenové oblasti - vysoký stupeň interindividuální variability - polymorf ní úsek DNA (lokus), který je vytvořen tandemovým uspořádáním mnohočetných kopií krátkých sekvencí DNA PCR Real-time ĎNA genotypizace (kvantifikace alel nebo SNP) určovaní druhů, SNP, kvantifikace (HRM = analýza tání s vysokým rozlišením) RNA kvantifikace transkriptu Interkalační fluorescenční barva (SybrGreen) Taqman sondy kromě primerů značený oligonukleotid -fluorescenční značka (R) a tzv. zhášečem (Q) fluorescenční látka v těsné blízkosti zhášeče - fluorescence potlačena ĎNA polymeráza při syntéze narazí na značený nukleotid -vytěsnění z templátového vlákna a štěpení (Taq polymeráza - 5'-exonukleasová aktivita) uvolnění fluorescenční sondy do roztoku měření fluorescence v průběhu amplifikace intenzita fluorescence je úměrná množství nasyntezovaného PCR produktu. Polymerization 5' 3'- Forward Primer Q sa » R = Reporter Q = Quencher Strand Displacement s-3'- Cleavage Polymerization Completed 5' 3- Reverse Primer -3' iff -3' ■5' PCR Základní výzkum • izolace genů nebo jejich častí • sekvencovdní DNA • mutageneza in vitro • modif kace konců DNA • analýza (selekce) klonů z genových knihoven • příprava značených sond Aplikovaný genetický výzkum • prenatální diagnostika (dědičných chorob) • detekce mutací v genech • studium polymorfizmu genů (např. RAPĎ) • populační genetika • farmakogenomika PCR Využití v klinických disciplinách • detekce patogenních MO (baktérií, virů, prvoků, hub) • identifikace onkogenů • typizace nádorů • stanovení pohlaví Využití v praxi • archeologie • soudnictví • kriminalistika - VNTR • určování paternity Detekce polymorf ismu v genu pro interleukin-1 Detekce SNP rsll43634 IL-1|& +3953C/T PCR - postup 1) popsat mikrozkumavky 2) rozmrazit a promíchat chemikálie, Taq polymerázu udržovat v chladu 3) připravit MasterMix (viz. rozpis), protřepat, centrifugovat zkumavky, rozpipetovat MM do mikrozkumavek 4) rozpipetovat DNA do mikrozkumavek 5) zakopnout minerálním olejem 6) vložit mikrozkumavky do termocykleru 7) nastavit program v termocykleru a zapnout běh Detekce polymorf ismu v genu pro interleukin-1 PCR - reakční směs Master Mix (MM) roztok Množství v jl/I na 1 vzorek Množství v jl/I na vzorků PCR voda 12,5 Puf r ĎYNEX 2,5 MgCI2 (25 mM) 4,0 Primer forward IL-ip> 1,25 Primer reverse IL-l(b 1,25 dNTP 0,5 Taq polymerasa (1 Ujl/I1) 1,0 23,0 fj\ MM + 2,0 fj\ templátové DNA (50 r\g/j\A) + 1 kapka minerálního oleje na 1 vzorek Primery IL-1BF CTC AGG TOT CCT CGA AGA AAT CAA A - forward (Ta = 58,79°C) IL-1BR GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG - reverse (Ta = 58,80°C) Detekce polymorf ismu v genu pro interleukin-1 PCR - průběh • v termocykleru Sensoquest labcycler (Schoeller) 1. 95°C 5 minut 2. 95°C 1 minuta 3. 60°C 1 minuta 4. 72°C 1 minuta krok 2.- 4. - cyklus 35x 5. 72°C 7 minut 6.10°C 10 minut Detekce polymorf ismu v genu pro interleukin-1 RA - postup 1) popsat mi kro zkumavky 2) rozmrazit a promíchat chemikálie 3) připravit MasterMix (viz. rozpis), protřepat, centrifugovat zkumavky, rozpipetovat MM do mikrozkumavek 4) rozpipetovat amplikon do mikrozkumavek 5) zakopnout minerálním olejem 6) vložit mikrozkumavky do termostatu na 65°C a inkubovat min. 4 hodiny Master Mix (MM) roztok Množství v jl/I na 1 vzorek Množství v jl/I na vzorků RA voda 1,0 Puf r pro TaqI 17 Enzym TaqI 0,3 3,0 jl/I MM + 15,0 jl/I amplikonu + 1 kapka minerálního oleje na 1 vzorek enzym Taql 5 -TUC6A-3 3 -A6CÍÍT- 5 I CC 99 bp + 77 bp CT 176 bp + 99 bp + 77 bp TT 176 bp SNP rsll43634 IL-lfb +3953C/T Sekvence TAGTGGAAAC TATTCTTAAA GAAGATCTTG ATGGCTACTG ACATTTGCAA CTCCCTCACT CTTTCTCAGG GGCCTTTCAC TTACATTGTC ACCAGAGGTT CGTAACCTCC CTGTGGGCTA GTGTTATGAC CATCACCATT TTACCTAAGT AGCTCTGTTG CTCGGCCACA GTGAGCAGTA ATAGACCTGA AGCTGGAACC CATGTCTAAT AGTGTCAGGT CCAGTGTTCT TAGCCACCCC ACTCCCAGCT TCATCCCTAC TGGTGTTGTC ATCAGACTTT GACCGTATAT GCTCAGGTGT CCTCCAAGAA ATCAAATTTT GCCGCCTCGC CTCACGAGGC CTGCCCTTCT GATTTTATAC CTAAACAACA TGTGCTCCAC ATTTCAGAAC CTATCTTCTT y (c/t) GACACATGGG ATAACGAGGC TTATGTGCAC GATGCACCTG TACGATCACT GAACTGCACG CTCCGGGACT CACAGCAAAA AAGCTTGGTG ATGTCTGGTC CATATGAACT GAAAGCTCTC CACCTCCAGG GACAGGATAT GGAGCAACAA GGTAAATGGA AACATCCTGG TTTCCCTGCC TGGCCTCCTG GCAGCTTGCT AATTCTCCAT GTTTTAAACA AAGTAGAAAG TTAATTTAAG GCAAATGATC AACACAAGTG AAAAAAAATA TTAAAAAGGA ATATACAAAC TTTGGTCCTA GAAATGGCAC ATTTGATTGC ACTGGCCAGT GCATTTGTTA ACAGGAGTGT GACCCTGAGA AATTAGACGG CTCAAGCACT CCCAGGACCA TGTCCACCCA IL-1BF CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A IL-1BR GCT TTT TTG CTG TG A GTC CCG Salivary biomarkers of existing periodontal disease: a cross-sectional study. J Am Dent Assoc. 2006 Mar;137(3):322-9. Miller CS, King CP Jr, Langub MC, Kryscio RJ, Thomas MV. BACKGROUND: The authors conducted a study to determine if salivary biomarkers specific for three aspects of periodontitis inflammation, collagen degradation and bone turnover correlate wiih clinica features of periodontal disease. METHODS: The relationship between periodontal disease and the levels of interleukin-1 beta (IL-lbeta), matrix metalloproteinase (MMP)-8, and osteoprotegerin (OPG) in whole saliva of 57 adults (28 "case" subjects with moderate-to-severe periodontal disease and 29 healthy control subjects) was examined in a case-control trial. RESULTS: Mean levels of IL-lbeta and MMP-8 in saliva were significantly higher in case subjects than in controls. Both analytes correlated with periodontal indexes, whereas, after adjustment for confounders, OPG did not. Elevated salivary levels of MMP-8 or IL-lbeta (more than two standard deviations above the mean of the controls) significantly increased the risk of periodontal disease (odds ratios in the 11.3-15.4 range). Combined elevated salivary levels of MMP-8 and IL-lbeta increased the risk of experiencing periodontal disease 45-fold, and elevations in all three biomarkers correlated with individual clinical parameters indicative of periodontal disease. CONCLUSION: Salivary levels of MMP-8 and IL-lbeta appear to serve as biomarkers of periodontitis. CLINICAL IMPLICATIONS: Qualitative changes in the composition of salivary biomarkers could have significance in the diagnosis and treatment of periodontal disease. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/