PRAKTIKUM č.2 ÚKIA, LF MU, Mgr. Olga TICHÁ PROTILÁTKY • protilátky jako základní reagens při imunologických metodách • základní charakteristika reakce Ag – Ab Obecné principy reakce Ag - Ab Antigen – látka schopná vyvolat imunitní reakci vazebné místo: EPITOP (antigenní determinanta) Protilátka vazebné místo: PARATOP AFINITA (epitop s paratopem) a AVIDITA nativní rekombinantní monoklonální polyklonální PROTILÁTKY (Ab) Fab Fc Rozeznání Fc Ab makrofágem TŘÍDA PROTILÁTEK •dle typu konstantního řetězce Interakce volného Ag s volnými Ab AFINITA •vazba Ag-Ab zahrnuje vodíkové můstky, iontové vazby, hydrofóbní interakce, van der Waalsovy síly •dána velikostí síly mezi jedním vazebným místem Ab a jedním epitopem Ag AVIDITA •dána vícenásobnou interakcí mezi multivalentní Ab a Ag (opakovaný epitop na povrchu) •POZOR! •Antigenem může být i protilátka!!! PŘÍPRAVA MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK I. Příprava MP-I MAb II. • Příprava MP-2 • Příprava MP-III MAb III. Příprava MP-IV MAb IV. • MAb PEG MAb POUŽÍVANÉ K TERAPII •Myší (celé) -momab •Chimérické (myší VH VL ) -ximab •Humanizované (myší hypervar.úseky) -zumab •Lidské (připravené technikami mol.biol. dle knihoven) Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob •Imunosuprese: • - anti-CD3 (OKT3), –anti CD25 (basiliximab, daclizumab), –anti CD20 (rituximab) •Blokáda prozánětlivých cytokinů: –Anti –TNF-a (infliximab, adalimumab) – revmatoidní artritida, Crohnova choroba, •Blokáda adhezivních molekul: –anti integrin a4b1 (natalizumab) – roztroušená mozkomíšní skleróza –Anti-CD11a (efalizumab) - psoriáza •Protialergická léčba –anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu Monoklonální protilátky v humánní medicíně •Transplantologie Muronomab-CD3 , Basiliximab (IL2r alfa, chim.), Daclizumab (IL2r alfa, hum.) •Kardiologie Abciximab (glykoprotein IIb a IIIa trombocytů, chim.) •Revmatologie Infliximab (TNFalfa, chim.) Adalimumab (TNFalfa, lidská) •Gastroenterologie Infliximab (TNFalfa, chim.) •Infekční lékařství Palivizumab (F-protein RSV, hum.) •Neurologie Natalizumab (inhibitor adhesivní molekuly a4 b1) - SM Monoklonální protilátky v humánní medicíně •Onkologie Trastuzumab (HER2 onkoprotein, hum.), ca mammae Cetuximab (epithelial growth factor receptor EGFR1, chim.), Edrecolomab (epithelial cell adhesion molecule, myší) kolorektální ca •Hematoonkologie Rituximab (CD20 na B-lymfocytech, chim.) nehodgkinský lymfom, CLL Alemtuzumab (CD52 na B,T,NK,mono, hum.) CLL •Alergologie Omalizumab (humanisovaná anti IgE) Produkce antigenů a protilátek v transgenních rostlinách •Rekombinantní protilátky SIgA/G Streptococcus mutans (tabák) IgG HSV2glykoprotein B ( sója) scFv-bryodin 1 imunotoxin CD40 (tabák,bun.susp.) •Rekombinantní podjednotkové vakcíny HBsAg (tabák) Glykoprotein viru vztekliny (rajče) Termolabilní enterotoxin E.coli (tabák, brambory) Virus prasečí gastroenteritidy (tabák, kukuřice) (Ma KCJ et al.: Nature Rev Genetics 2003; 4: 794-805) CVIČENÍ Č.1 •Úkol č.1: ředění geometrickou řadou • (sloupce 1,2) • •Úkol č.2: pipetování do mikrotitrační destičky • (sloupce 3-11) Geometrická řada destil.voda 600 ml 600 ml 600 ml 600 ml 600 ml 600 ml 600ml 600 ml 600 ml 600 ml ŘEDÍCÍHO ROZTOKU 1 2 3 4 5 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 600 ml 1:1 A B C D E F G H 1:2 1:4 1:8 ŘED.R. 1:16 1:32 ŘED.R. H2O A B C D E F G H 1:2 1:4 1:8 ŘED.R. 1:16 1:32 ŘED.R. H2O sl. 1 sl. 2 Do jamky vždy jen 100ul z naředěné geom. řady. Zbytek destičky dopipetovat ředícím roztokem: sl. 3-5 - dopipetovat 8-kanálovou pipetou sl. 6-8 – dopipetovat opakovací pipetou (=stepper) sl. 9-11 - dopipetovat 1-kanálovou pipetou PROTOKOLY v hlavičce: jméno datum úloha č. název úlohy v protokolu samotném: Princip Postup Výsledky Závěr …grafy… PROTOKOL Č.1 •Princip: Okomentovat význam správného pipetování •Postup: pomůcky, schémátko •Do výsledků: min. hodnota, max. hodnota, průměr, směrodatnou odchylku jen u absorbancí nenáležejících ke geometrické řadě (sl.3-11)