Aglutinace Mgr. Jana Nechvátalová Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny v Brně Protilátka • Variabilní oblast lehkého řetězce Konstantní oblast lehkého řetězce Lehký řetězec Těžký řetězec Variabilní oblast těžkého řetězce Konstantní oblast těžkého řetězce Hypervariabilní úseky paratop File:2fab fc.svg File:F ab2 pFc.png Enzym papain Enzym pepsin fragment antigen binding fragment crystallizable ( + antigen) ( + Fc receptor) http://en.wikipedia.org/wiki/Fragment_crystallizable_region Ag – Ab imunokomplex epitop paratop http://www.wikipremed.com/image.php?img=040708_68zzzz382750_255px-Antibody.svg_68.jpg&image_id=3827 50 afinita ≠ avidita •afinita - síla interakce mezi jedním • paratopem a jedním epitopem • •avidita - závislá na afinitě • - vazebná energie mezi komplexním • antigenem a protilátkou • - bere v úvahu valenci Ag a Ab • Klasické serologické reakce Aglutinace – reakce mezi korpuskulárním Ag a Ab s následnou aglutinací částic; proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Ab Precipitace – reakce mezi solubilním Ag (nízkomolekulární) a Ab s následným vznikem precipitátu proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Ab Imunoeseje – reakce mezi Ag a Ab vizualizována enzymem, fluorochromem n. radioaktivním zářičem (EIA, RIA n. FIA) ; většinou proběhne jen 1. fáze inter. Ag a Ab Metodiky využívající efektorového účinku Ab: Metodiky s aktivací komplementového systému komplexem Ag – Ab, např. komplement-fixační reakce (KFR) Metodiky s inhibicí biologických účinků některých Ag, např. neutralizační test, hemaglutinačně inhibiční test (HIT) REAKCE Ag a Ab File:Antigen excess.jpg Dynamika tvorby imunokomplexů Malé rozpustné imunokomplexy Malé rozpustné imunokomplexy Velké nerozpustné imunokomplexy •primární fáze – rychlá; vznik vazby jednotlivých epitopů s vazebnými místy protilátek; není patrná okem • •sekundární fáze – vznik prostorového komplexu; uplatňuje se multivalence Ag a polyvalence Ab (IgM-pentamer=10 vazeb.míst, ovšem reálně je k dispozici 5-6); patrné okem nebo koloidní roztok → analyzátory Reakce Ag - Ab Aglutinace x precipitace •Aglutinace • •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát •makromolekulární •korpuskulární •nerozpustný • •Protilátky namířené proti epitopům antigenních částic vytváří mezi •korpuskulemi můstky, které vedou ke vzniku shluků – aglutinátů. •jako Ag slouží např. těla bakterií • • •Precipitace • •Ag + Ab ® Ag-Ab •precipitinogen precipitin precipitát •nízkomolekulární •nekorpuskulární •rozpustný • •Reakce mezi solubilním antigenem a protilátkou s následným vznikem •precipitátu (hydrofobní vazby – vzniká nerozpustný komplex). • • Aglutinace Přímá Ag jsou přirozeně součástí povrch. struktur reagujících částic (antigeny krevních skupin) Př. hemaglutinace Nepřímá Ag navazujeme na povrch částice uměle Př. latex-fixační test – Ag nebo Ab navázaný na latex. částici, pokud dojde k aglutinaci, dokazujeme přítomnost Ab nebo Ag Vyšetření revmatoidního faktoru (RF) Latexové částice potažené lidským gamaglobulinem. Při zvýšené konc. Rf dojde k aglutinaci (pozitivní výsledek) Revmatoidní faktor (RF) •je protilátka proti Fc fragmentu molekuly IgG • •běžně se vyskytuje v séru ve vysokých koncentracích zejména u pacientů trpících revmatoidní artritidou (70-90% má pozitiv. RF) •při RA mají prognostický význam: vysoké koncentrace RF asociují s těžkým průběhem onemocnění. •systémové imunopatologické choroby - lupus erythematodes - Sjögrenův syndrom aj. http://www.abbottdiagnostics.sk/App_Publisher/UserFiles/Products/Images/antiCPP-revmatiodni-artriti da.jpg Antistreptolyzin O (ASLO) •streptolyzin O je produkovaný ß hemolytickými streptokoky skupiny A •zvýšení titru protilátek proti streptolyzinu O je známkou nedávné infekce ß hemolytickými streptokoky skupiny A • •diagnostika: - streptokokové anginy (80 – 85 % jedinců s prbíhající streptokokovou infekcí nebo následným onemocněním má zvýšený titr ASLO) - spály, akutní revmatické horečky a akutní glomerulonefritidy Coombsův test (antiglobulinový test, AGT) •umožňuje detekci červených krvinek, pokrytých imunoglobuliny (antierytrocytární protilátky) nebo složkami komplementu • • • • http://cs.wikipedia.org/wiki/Coombs%C5%AFv_test nepřímý umožňuje detekci antierytrocytárních protilátek přítomných v pacientově séru či plazmě z důvodu „in vitro“ senzibilizace červených krvinek nepřímý Coombsův test je užíván k prenatálnímu testování těhotných žen a k testování krve před krevní transfúzí. Slouží k detekci protilátek proti červeným krvinkám, které jsou přítomny volně nenavázané v séru pacienta. V tomto případě je sérum extrahováno z krve a následně inkubováno s erytrocyty se známou antigenicitou. Pokud dojde k aglutinaci, je nepřímý Coombsův test pozitivní. přímý umožňuje detekci červených krvinek senzibilizovaných imunoglobuliny a složkami komplementu „in vivo“ přímý Coombsův test se užívá k detekci protilátek či proteinů komplementu, které jsou navázány na povrch červených krvinek. Odebraný vzorek krve je zpracován tak, že přítomné červené krvinky jsou promyty (čímž se odstraní pacientova plazma) a následně se inkubují s protilátkami proti lidským imunoglobulinům (Coombsovo reagens). Pokud dojde k viditelné aglutinaci červených krvinek, přímý Coombsův test je považován za pozitivní, což je důkazem, že protilátky či proteiny komplementu jsou navázány na povrch erytrocytů. Přirozené protilátky •tvoří se již brzy po narození, spontánně, bez záměrné imunizace, jako odpověď na přirozené stimuly (izohemaglutininy – anti-A, anti-B) •jsou polyreaktivní s nízkou aviditou •většina patří do isotypu IgM (IgM také nejvíce aglutinuje, je to pentamer) •normální sérum zdravých jedinců obsahuje přirozené protilátky IgM, IgG a IgA •jejich fyziologický význam se předpokládá: - v časných stádiích infekčních procesů - při regulaci rozvoje autoimunitních chorob - též při odstraňování stárnoucích, fyziologicky degradovaných molekul a buněk