Chromatografie_2013 Chromatografie Petr Breinek Využití chromatografie v KB •Nejčastěji kapalinová chromatografie. •Co se stanovuje? • HbA1c, léky, vitaminy, hormony, metanefríny, toxikologie, … Tosoh_HbA1c HPLC%201200%20Series Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální dělení složek analyzované směsi mezi dvěma fázemi. • Pohyblivá fáze (mobilní), eluent • Nepohyblivá fáze (stacionární) 80px-Chromatography_of_chlorophyll_-_Step_7 Výsledek chromatografie chlorofylu v Chromatografie plynová (GC; Gas Chromatography), v Chromatografie kapalinová (LC; Liquid Chromatography) Různá hlediska dělení chromatografie Podle povahy mobilní fáze Podle systému fází Mobilní fáze Stacionární fáze Mechanismus dělení Metoda Plyn Kapalina Rozdělovací GLC Pevná látka Adsorpční GSC Sítový efekt GSC Kapalina Kapalina Rozdělovací LLC, TLC Sítový efekt GPC Pevná látka Adsorpční LSC Iontová výměna IEC Chemická reakce Afinitní chromatografie vKolonová (sloupcová) - stacionární fází (ukotvenou na vhodném materiálu) je naplněna skleněná či kovová kolona a mobilní fáze protéká kolonou pomocí gravitace nebo pumpy v v Plošná (planární) - papírová - tenkovrstevná (TLC; Thin Layer Chromatography) v Podle způsobu provedení je založena na různé velikosti rozdělovacích koeficientů (K) dělených látek mezi dvěma nemísitelnými nebo omezeně mísitelnými kapalinami O separaci rozhoduje různá rozpustnost dělených látek ve stacionární a mobilní fázi Kapalina 1 butanol Kapalina 2 voda C1 C2 + Z K = c1/c2 Rozdělovací chromatografie je založena na rozdílných adsorpčních schopnostech jedné látky k povrchu druhé látky(adsorbentu) tvořící stacionární fázi Stacionární fáze je adsorbent (sorbent) üPolární (např.silikagel, oxid hlinitý a křemičitý) üNepolární (např. aktivní uhlí) v Adsorpční chromatografie dělení látek je založeno na schopnosti výměny iontů na pevném nosiči (matrici) Stacionární fází je iontoměnič (ionex ) üAnexy („přitahují anionty“) üKatexy („přitahují kationty“) v v Mobilní fází jsou nejčastěji vodné roztoky Iontově výměnná chromatografie také chromatografie na „molekulových sítech“ dělení látek na gelu je založeno na velikosti molekul · Stacionární fází je neionizovaný přírodní nebo syntetický gel. Gelová C.PNG Gelová chromatografie využívá vlastnosti biologicky aktivní látky vytvářet specificky reverzibilní komplex s jinou molekulou (chemická reakce). Stacionární fáze obsahuje zakotvené ligandy, na které se rozdělovaná látka váže. Afinitní chromatografie affinity-chromatography.gif • Extrakce kapalinou • Extrakce pevnou látkou (SPE) • Ultrafiltrace • Derivatizace • Extrakce plynem (headspace) • Adsorpce • Vymrazování vials-1a.jpg Příprava.jpg Techniky úpravy vzorků Plošná (planární) chromatografie • TLC.png thin_layer_chromatography_1110.jpg Vysokotlaká pumpa (v případě gradientové eluce je nutná druhá pumpa a mísič) Injektor Dělící kolona Detektor Vyhodnocovací zařízení (zapisovač, PC, tiskárna) Hlavní součásti kapalinového chromatografu HPLC%201200%20Series Typ eluce ØIsokratická ØGradientová (v průběhu dělení se mění složení mobilní fáze) Reverzní fáze (stacionární fáze je méně polární než fáze mobilní) HPLC – jednoduché schéma • hplc Eluční činidlo Pumpa až 350 barů Nanesení vzorku Kolona Detektor Odpad Převodník signálu Zapisovač 17 Kolona, eluční pufry Tosoh_HbA1c • UV/VIS • Detektor s diodovým polem (Diode Array Detector) • Fluorescenční • Plamenový ionizační (FID) • Elektrochemický (coulometrický, ampérometrický,….) • Hmotnostní spektrometr (MS) Detektory Chromatografický záznam • MycophenolicAcid Základní pojmy Fáze Průtok (flow rate, ml/s) Retenční čas (minuty) Pík Výška píku; Plocha píku; Šířka píku Šum Drift Účinnost kolony Teoretické patro = minimální délka kolony nezbytná pro ustavení 1 cyklu rovnováhy mezi fázemi; 50 000 -100 000 teoretických pater na 1m délky 1.Přímé srovnání plocha nebo výška píku srovnání s kalibrátorem (externí standard) 2. Metoda vnitřního standardu plocha nebo výška píku srovnání poměru plochy nebo výšky píku stanovované látky s vnitřním a externím standardem 3. Metoda standardního přídavku Kvantifikace (vyhodnocení) Plynová chromatografie (GC) •Dělená směs musí procházet kolonou v plynném stavu Plyn - Kapalina Rozdělovací Plyn - Pevná látka Adsorpční • Plamenový ionizační (FID) • Tepelně vodivostní (TCD) • Elektronového záchytu (ECD) • Hmotnostní spektrometr (MS) Detektory GC_FID Plamenový ionizační detektor (FID) Měření změny ionizačního proudu vodíkového plamene v důsledku přítomnosti iontů vzniklých při spálení Hmotnostní spektrometrie (MS) Analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty v plynné fázi ve vakuu a rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) Principem MS je pohyb iontů v elektrickém nebo magnetickém poli v závislosti na jejich hmotnosti a náboji • Hlavní součásti hmotových spektrometrů •Iontový zdroj (destrukce molekul na fragmenty) •Hmotnostní analyzátor •Detektor dopadajících fragmentů Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Vzorek (vakuum) (vakuum) Magnetické pole Luminiscence _ 2013 LUMINISCENČNÍ metody Petr Breinek Bioluminiscence v přírodě medúza Světlušky, medúzy, dřevokazné houby, hlubokomořské ryby,…… Jellyfish Luminiscence je jev, při kterém vzniká světlo (fotony) po předchozím dodání energie (excitaci) materiálu (luminoforu) Luminiscence je charakteristická svojí dobou trvání, která o několik řádů převyšuje doby života termálních kmitů (záření černého tělesa), t.j. tepelné záření není luminiscence! LUMINOFOR/ FLUOROFOR TEPLO SVĚTLO EMITOVANÉ záření LUMINISCENCE EXCITAČNÍ záření 30 Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace ü Fotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla ü Chemiluminiscence a bioluminiscence - zdrojem energie je chemická reakce ü Elektroluminiscence – zdrojem je el. proud; Katodoluminiscence – zdrojem je proud elektronů ; Thermoluminiscence; Radioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření; Mechanoluminiscence – zdrojem je mechanická energie; Krystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí; další zdroje Luminofory/fluorofory jsou molekuly nebo jejich části, které vyzařují luminiscenční záření (fluoreskují) üPřirozené üAnalytické (fluorescenční značky nebo sondy) Přirozené luminofory/fluorofory • •Polyaromatické uhlovodíky •Vitamin A, E •FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH •NADH (340/460 nm) x NAD+ •Karoteny •Chinin •Steroidy •Aromatické aminokyseliny •Nukleotidy •Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein ) Použití GFP v chemii a biologii •Nejde o bioluminiscenci (chemiluminiscenci), ale o fotoluminiscenci (excitace lampou, nebo laserem) •obecně lepší rozlišení při sledování mikroskopem •sledování genové exprese •medicína a biologie: sledování metastáze tumoru Analytické luminofory/fluorofory • Luminol, isoluminol • Fluorescein • Methylumbelliferon (MU) • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Cheláty lanthanoidů (Europium) Nejčastěji jsou navázány jako značka (na protilátky nebo antigeny) nebo jsou použity jako substrát. Luminol (5-aminoftalhydrazid) •2H2O2 = 2 H2O + O2 (peroxidasa) •Luminol + 2H2O +O2 ® aminoftalát + N2 +3H2O+ světlo • (1928) – oxidace v bazickém prostředí příklad použití: intenzivní reakce s hematinem detekce krevních skvrn) luminol2 Methylumbelliferon (MU) •MUP MU + P + luminiscence •4-metylumbelliferyl fosfát 4-metylumbelliferon + fosfát • + luminiscence • • • • •(defosforylace substrátu) MFCD00016969 Chemiflex™ (Abbott) Patentovaný ester akridinu akridinium(N-sulfonyl)karboxamid Sloučenina je velmi stálá Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) Lumigen® (Siemens, DPC) Fosfátový ester adamantyl dioxetanu Reakce: - defosforylace substrátu účinkem ALP - vznik nestabilního meziproduktu v excitovaném stavu - při jeho tvorbě je emitován tok fotonů 39 Luminiscence lanthanoidů Některé komplexy Ln(III) mají velmi neobvyklé spektrální vlastnosti: ü dlouhý čas vyhasínání luminiscence ü Stokesův posun může být i více než 100 nm ü emisní spektrum obsahuje ostré píky Fotoluminiscence •Podle dosvitu sekundárního záření dělíme fotoluminiscenci na: • Fluorescenci (10-9 -10-5 s ) • Fosforescenci (10-2 s až dny) •Absorpce primárního záření v oblasti gama, rentgenového, ultrafialového nebo viditelného spektra • Fluorimetrie – absorpce UV záření • Přístrojová technika •Zdroj exitačního záření (Hg výbojka, halogenové výbojky, Xe výbojka, lasery). •Filtr (Woodův fitr skla s příměsí NiO, CuO, CoO). •Měřicí prostor •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál. •Detektor • 42 Emisní spektrum Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii Stokesův posuv l • Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay • • Protilátky nebo antigeny jsou značeny cheláty lanthanoidů: Eu (europia), Sm (samaria) a Tb (terbia) • Cheláty lanthanoidů vykazují velký Stokesův posun a delší dobu emise. • (Pozn.: použití jako luminofor v obrazovkách barevných televizorů) • Nekompetitivní sendvičová technika chráněná patentem. DELFIA • •Po imunochemické reakci se tento chelát přemění na fluoreskující sloučeninu •Detekce záření se zpožděním (odstranění interferujícího záření) •Pulzní zdroj (340nm, tisíce pulzů/s) • Po každém záblesku: • 400 µs prodleva • 400 µs měření emitovaného záření • (Nespecifická emise 10 ns) • • • • • •Kongenitální hypotyreóza (SKH) • Snížená funkce štítné žlázy vede ke zvýšení koncentrace TSH •Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) • Defekt steroidogeneze v kůře nadledvin; • nejčastěji deficit enzymu P450c21 (21-hydroxylázy) • zvýšení koncentrace 17 OHP (17-0H-progesteronu) • •Fenylketonurie/hyperfenylalaninémie Využití: „Celoplošný laboratorní novorozenecký screening“ • •Homogenní fluorescenční imunoanalýza •Využití kryptandů (=sloučeniny, které fluorofor Eu3+ váží v trisdipyridylové „kleci“ •Kryptandem je značený antigen nebo protilátka •Na druhou protilátku je vázán fluorofor, který je excitován při jiné vlnové délce než Eu •Imunokomplex je excitován laserem při 337 nm •Energie přenesená z kryptandu na fluorofor je detekována při 665 nm jako prodloužený signál TRACE Time Resolved Amplified Cryptate Emission Časové modulovaná detekce fluorescence • je vyvolána energií chemické reakce (většinou oxidace) •Jednoduché přístrojové vybavení bez zdroje primárního záření, nižší vliv matrice, stanovení nižších koncentrací •Elektrochemiluminiscence • je modifikace chemiluminiscence, kdy luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky • Chemiluminiscence CMIA Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích •Heterogenní imunoanalýza - separace pevnou fází •Paramagnetické mikročástice •Emise světla molekulou, která je produktem chemické reakce • •Systém není ozařován zdrojem světla. Paramagnetické částice Krystaly kysličníků železa v velký povrch v magnetické vlastnosti CMIA CMIA • modifikace chemiluminiscence, světlo je generováno chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky • • • ECLIA Elektrochemiluminiscenční imunoanalýza Elecsys 2010 Elecsys 2010 (Roche) üCheláty ruthenia se používají jako luminiscenční značka vzniklých imunokomplexů üNa platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+, zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+(má redukční vlastnosti), snadno redukuje Ru3+komplex na Ru2+, Ru kation prochází reakcí cyklicky, nespotřebovává se, chová se jako enzym üelektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny Ru kationtu, přechodem do základního stavu dojde k luminiscenci a Ru komplex je opět schopen další oxidace üTPA se rozpadá na dipropylamin, je v reakci spotřebováván, slouží jako substrát •