Elektroforetické metody
Petr Breinek
Elektroforéza_N2012
Elektroforéza je analytická metoda
založená na rozdílné pohyblivosti nabitých
částic v elektrickém poli v tekutém mediu.
Pohyblivost částic závisí na:
• velikosti náboje
• velikosti a tvaru částice
• hmotnosti částice
• vlastnostech prostředí
Bílkoviny: elektrický náboj
Při pH = 8,6 putují bílkoviny od katody (-) k anodě (+)
1.Volná (Arne W. Tiselius – Nobelova cena;1948)
Vodné roztoky (elektrolyty)
Částice putují k elektrodě s opačnou polaritou
Problém: vznikající teplo,….
Rozdělení elektroforetických technik
1.Volná
2.Zónová na nosičích
Izoelektrická fokuzace (IEF)
SDS gelová elektroforéza
Dvojrozměrná (two-dimensional, 2-DE))
Kapilární elektroforéza (CE)
Izotachoforéza
Rozdělení elektroforetických technik
Nosiče
- Papír
- Acetátcelulozová folie
- Gel
Agarózový gel
Škrobový gel
PAGE - SDS
Polyakrylamidový gel (PAGE,polyacrylamide
gel electrophoresis)
sítový efekt; endoosmóza,..
Postup (zjednodušeně):
- Aplikace vzorků
- Dělení
- Fixace a barvení
- Odbarvení
- Sušení
- Vyhodnocení
- pH = 8,6
Elektroforéza bílkovin v krevním séru
Automatický elektroforetický přístroj
Hydrasys (Sebia,Francie)
Vyhodnocení elektroforeogramů
 vizuální hodnocení
 denzitometricky
 skener
 ……..
IZOENZYMY
15 ISO LD
LIPOPROTEINY
IMMUNOFIXACE
4 IF
PAGE SDS elektroforéza
SDS = dodecylsíran sodný
Zrušení disulfidických vazeb, bílkoviny získají stejný
elektrický náboj, pohyblivost závisí na molekulové
hmotnosti
PROTEINURIE
5 PROTEINURIE
IZOELEKTRICKÁ FOLUZACE
(IEF)
• IEF je technika rozdělující bílkoviny podle
jejich izoelektrických bodů (pI)
• Dělení probíhá v gelu s lineárním pH
gradientem vytvořeným směsí amfolytů
(100-200), každý amfolyt má jiný
izoelektrický bod
Příklad využití IEF
Stanovení oligoklonálních pásů IgG v likvoru
• Bez zahuštění likvoru
• Současně se analyzuje sérum a likvor (ve
stejné koncentraci)
• Imunochemická detekce a barvení
Stanovení oligoklonálních IgG pásů v
likvoru a v krevním séru metodou
izoelektrické fokuzace s následným
imunofixačním barvením umožňuje
kvalitativní vyjádření intratekální syntézy
IgG.
Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE)
 Nejdříve jsou proteiny rozděleny podle svých
izoelektrických bodů (IEF)
 a následně se proteiny dělí v závislosti na jejich
molekulové hmotnosti (SDS-PAGE)
Použití:
Separace
komplexních
směsí
bílkovin
(proteomika)
Až několik tisíc
proteinových skvrn!
Elektroforéza 2-DE
PAGE-IEF PAGE-SDS
Kapilární elektroforéza
 Je technika založená na principu
elektrokinetické separace v kapiláře
malého vnitřního průměru (10 až100 µm),
dlouhé 20 až 200 cm; naplněné
elektrolytem při vysokém napětí (7 700 V)
 Různé provedení (gel, IEF, volná,…)
 Výsledkem je rychlá a velice účinná
separace molekul s výborným rozlišením.
 Roztok putuje kapilárou najednou
Kapilární elektroforéza (CE)
CAPILLARYS