Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 4: Metody identifikace bakterií, principy biochemické identifikace Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz Postavení v systému metod nPřímé metody (prokazujeme mikroba – jeho část – jeho produkt): nMikroskopie – průkaz ve vzorku i id. nKultivace – průkaz ve vzorku i identifikace nBiochemická identifikace – jen identifikace! nPrůkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. nPrůkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku nPokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku nNepřímé metody (protilátky) Obecný princip I nJak jsme si řekli při povídání o fyziologii mikrobů, bakterie mají svůj metabolismus. nPrůmyslová mikrobiologie využívá bakteriálního metabolismu (zejména fermentativního katabolismu) k výrobě různých látek, včetně řady potravin nKlinická mikrobiologie využívá vzájemných rozdílů v metabolismu mezi bakteriemi nZajímají nás přitom mezidruhové rozdíly. Rozdíly mezi kmeny jsou spíše na obtíž 01 Alcohol Fermentation Etanolová fermentace www.kcpc.usyd.edu.au Obecný princip II nI mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano nBakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor nExistuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Samozřejmě že… nje velký rozdíl, jestli bakterie provádějí fermentaci nebo aerobní respiraci nje rozdíl, jestli bakterie štěpí spíše bílkoviny a aminokyseliny (například rod Proteus) nebo spíše cukry (například rod Klebsiella) nčasto je štěpení určitého substrátu znakem adaptace na určité prostředí (dobře adaptované enterobakterie štěpí laktózu, kterou nacházejí v našem střevě) Pro připomenutí… nJestlipak víte, že jste se s takovým biochemickým testem už vlastně setkali? Že ne? Ale ano, u kultivace. ENDOVA PŮDA Kult9 v sobě zahrnuje biochemický test: rozlišuje bakterie na ty, které umějí štěpit laktózu, a ty, které to neumějí. www.medmicro.info Problémy nRozdíly jsou i mezi kmeny, nejen mezi druhy nMálokdy pozorujeme, že 100 % či 0 % kmenů určitého druhu tvoří daný enzym nČastěji je to 90 %, 10 %, 70 %, 30 %… nJak to třeba může vypadat v praxi: nJaničkella tvoří lenkulázu v 90 % případů nEvičkella tvoří lenkulázu v 10 % případů nLenkuláza-pozitivní mikrob = ??? •typická Janičkella ??? •atypická Evičkella ??? Problémy – řešení nSledujeme-li jen jeden znak, je velká pravděpodobnost, že narazíme na atypický kmen a identifikace bude chybná nJe však velmi malá pravděpodobnost, že by se kmen choval atypicky např. v deseti různých testech najednou nProto čím víc testů, tím větší pravděpodobnost, že se nepleteme Pravděpodobnost výsledku nJak jsme si řekli, čím více testů použijeme, tím máme lepší šanci, že se nepleteme nPřesto tato šance nikdy není celých 100 % nDá se vždy říci například, že náš hypotetický kmen je nna 99,3 % Janičkella elegans nna 0,5 % Evičkella pulcherrima nna 0,2 % něco úplně jiného nJe pak na zvážení identifikujícího, zda mu taková míra pravděpodobnosti stačí, nebo zda provede další rozlišující testy Nejen procento pravděpodobnosti, ale i index typičnosti kmene nVe skutečnosti je výsledek biochemické identifikace zpravidla charakterizován dvěma čísly, nikoli jen jedním: n% pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne něco jiného nIndex typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je Tin = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude Tin nižší než 1,00 Příklady nKmen má identifikaci 99 %, index typičnosti 0,95. Ideální stav, pravděpodobně „je to ono“. nKmen má identifikaci 99 %, ale index typičnosti jen 0,63. Může jít o atypický kmen (je dobré zjistit, který test „mluví proti identifikaci), ale také o chybu diagnostiky nDva kmeny mají index typičnosti oba 1,00, procento pravděpodobnosti každý 49,5 % (jedno procento zbývá na „jiné“). To znamená, že je to určitě jeden z nich, ale bez rozlišujících testů nezjistíme, který to je. Jednotlivé testy, nebo kombinace? nJednotlivý test lze použít tam, kde potřebujeme vzájemně rozlišit dvě významné skupiny (čeledi, rody…) a kde existuje test, který má jedna skupina téměř ve 100 % pozitivní a druhá téměř ve 100 % negativní nKombinace jsou vhodné tam, kde testy mají více pravděpodobnostní charakter, a kde potřebujeme rozlišit více než dvě (někdy i desítky) skupin, rodů, druhů apod. Pohádka nByl jednou jeden nemocný student Petr. Měl půjčené nějaké věci od spolužáků, a teď ležel s angínou (způsobenou Streptococcus pyogenes) a nemohl jim je vrátit. Poprosil tedy sestru, aby se stavila před praktikem v šatně na mikrobiologii, a spolužákům věci vrátila. Dal jí k tomu příslušné instrukce Co řekl Petr Šárce nProtokoly vrátíš Honzovi. Honza má zelené oči, blond vlasy a nosí červenou mikinu. nSkripta vrátíš Matějovi. Matěj má taky zelené oči, taky blond vlasy, ale nosí modrou mikinu. nCD s Ewou Farnou vrátíš Liborovi. Libor má blond vlasy a nosí modrou mikinu, ale má modré oči. nFotky z kruhovky vrátíš Frantovi. Má modré oči a modrou mikinu, ale hnědé vlasy Šárka tedy musí sledovat několik znaků nPoužít jen jeden znak (třeba oči) by pomohlo při rozlišení dvou studentů, kteří se právě tímto znakem liší. nPokud je ale potřeba rozeznat studenty v rámci celé skupiny, je nutno většinou kombinovat více znaků nAby bylo možno rozlišení provést, je nutno předpokládat stálost výskytu znaků (Libor si nesmí obléct zelenou mikinu, Franta si nesmí obarvit vlasy na blond Identifikační tabulka Zelené oči Blond vlasy Modrá mikina Identifikace + + - Honza + + + Matěj - + + Libor - - + Franta Kdyby Šárka potkala příšeru… n…která by byla napůl Honza a napůl Franta, nemohla by studenta identifikovat. nStejně je to s bakteriemi. Abychom mohli identifikovat bakterie, musíme mít izolovaný kmen. nZ tohoto praktika existuje výjimka, o které se dozvíte na jaře až budeme probírat G- tyčinky. Možnosti praktického provedení nRychlé testy (vteřiny až minuty) nKatalázový test nTesty s diagnostickými proužky (oxidáza) nTesty s inkubací (hodiny až dny) nJednoduché zkumavkové testy nSložité zkumavkové testy nSady jednoduchých zkumavkových testů nTesty v plastové destičce (miniaturizace) nJiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test nKatalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2 à 2 H2O + O2 14 catalase medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Testy s diagnostickými proužky nTesty s dg. proužky – Reakční ploškou se dotkneme kolonií. V případě pozitivity ploška změní barvu. Nejběžnější jsou tyto: noxidáza – proužek zmodrá nINAC – proužek po několika minutách zmodrozelená nPYR – proužek po několika minutách, přikápnutí činidla a další minutě čekání zčervená nbetalaktamázový strip – týká se testování některých faktorů rezistence (viz příště) 08 oxidase3 Oxidázový test medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm Jednoduché zkumavkové testy nMohou probíhat v tekuté fázi, nebo v agaru. nV obou případech je ve zkumavce substrát, případně také indikátor. Substrát se může přidat i tak, že je substrátem napuštěna reakční ploška proužku (ONPG-test). nPozitivita testu = změna zbarvení (v celém objemu, nebo jako prstenec u hladiny) Příklady jednoduchých zkumavkových testů nArabinóza – tekutá. Zežloutnutí = pozitivní, zůstane zelená = negativní (pro enterokoky) nSimmons citrát – agarová. Zmodrání = pozitivní, zelená = negativní nONPG a VPT – s přidáním proužku. U ONPG tekutina zežloutne, u VPT se vytvoří červený prstenec u hladiny 13 citrate medic.med.uth.tmc.edu Složité zkumavkové testy nV jedné zkumavce probíhá více reakcí nNapř. test MIU. nM = motility – pohyb (zákal se rozlézá polotekutým agarem, nezůstává jen v místě vpichu) nI = indol (pozitivita = červený prstenec) nU = urea (štěpení močoviny indikuje zrůžovění celé půdy) nNebo Hajnova půda, která detekuje štěpení glukózy, tvorbu plynu z glukózy, štěpení laktózy a tvorbu sirovodíku MIU nMotility – pohyb. Pohyblivé bakterie rostou nejen kolem vpichu, ale v celém objemu zkumavky. nIndol (tvorba). U bakterií tvořících indol se po přidání Kovácsova činidla vytvoří červený prstenec na styku činidla a půdy nUrea (močovina). Štěpení močoviny – celý objem půdy zrůžoví MIU 16 motility MIU by samozřejmě šlo dělat i jako tři jednotlivé testy: pohyb… www.arches.uga.edu 11 indole …indol a ureu 15 urease2 medic.med.uth.tmc.edu 07a image013 Hajnova půda nČervený vršek – laktóza negativní nŽlutý vršek – laktóza pozitivní nČervený spodek – glukóza negativní nŽlutý spodek – glukóza pozitivní nČerný spodek – bakterie tvoří sirovodík nPotrhání půdy či odsunutí nahoru – bakterie tvoří plyny při fermentaci glukózy 06 velký Kligler_r%C3%A9sultats www2.ac-lyon.fr/ Sady zkumavek nSložité zkumavkové testy mají své nevýhody. Často při pozitivitě jednoho testu není vidět, zda je pozitivní test jiný. Špatně se automatizují a vyžadují dobře zaškoleného pracovníka nJednodušší, i když někdy dražší řešení, je sada několika jednoduchých zkumavkových testů nLze ovšem i zkombinovat testy složité a jednoduché (např. Hajna + MIU + Simmons citrát + ornithin dekarboxyláza + ureáza – používáno v naší laboratoři) Miniaturizace: testy v plastových panelech nMiniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů à testy v důlcích plastových mikrotitračních destiček. Místo každé zkumavky je jeden důlek nPočet testů v sadách kolísá od sedmi (NEISSERIAtest) po víc než padesát nLiší se v technických detailech. Vždy je však substrát vysušený, bakterie se nejprve rozmíchá ve fyziologickém roztoku nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků Provedení testů od firmy Erba Lachema (u nás nejběžnější) nVýrobce dodává destičky s vysušenými substráty, umístěnými na dně důlků v destičce nPracovník připraví suspenzi bakterie ve FR nebo v.suspensním médiu nDo každého důlku se kápne kapka či dvě kapky suspenze nZbytek suspenze se u některých testů ještě využije jako zkumavkový test s diagnostickým proužkem (ONPG, VPT) nDestička i zkumavka se inkubuje v termostatu NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) P1010002upr Foto: O. Z. Zahraniční soupravy 03 api50 05 PR020505 04 api-strip Bioch2 http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. Foto: O. Z. 02 API systémy www.ucd.ie/kyr/Images/jpgs/Photo16.htm Vyhodnocení destičkových testů nZ takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). nPříklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + nJe několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“ Možné způsoby hodnocení nPorovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. nPřepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno nVýsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické nPočítačové hodnocení se používá hlavně tehdy, pokud už „čtení“ výsledku probíhá automaticky, např. na spektrofotometru. Oktalové kódy – co to je a proč nMatematicky vzato je to vlastně převedení dvojkové soustavy (zápis + + – – + + – – –, respektive 110011000) do osmičkové soustavy (zápis 630) nZ praktických důvodů se zpravidla uvnitř trojice sčítá opačně – normálně by při převodu z dvojkové do osmičkové či desítkové soustavy 1 1 0 měla být šestka a 0 1 1 trojka, v praxi to však počítáme většinou naopak Oktalové kódy – II nV praxi se tedy každé trojici výsledků přiřadí číslice od nuly po sedmičku – viz následující obrazovka nPokud má test např. 17 reakcí (třeba velmi běžný ENTEROtest 16 k určování enterobakterií má 16 důlků + ONPG ve zbytku suspenze), je na konci místo trojice jen dvojice, v tom případě číslice na konci může být jen 0, 1, 2, 3. Pokud by reakcí bylo 16 (19, 22…) bude na konci nula nebo jednička. Praktický příklad nZaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí nPod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4 nSečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“, nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou) Test JAN LEN MAG TOM PET KAR FRA HAN Výsl. + – + + + – – – 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód 5 3 0 Přepočítávání trojic – – – 1 2 4 0 + – – 1 2 4 1 1 – + – 1 2 4 2 2 + + – 1 2 4 1 + 2 3 – – + 1 2 4 4 4 + – + 1 2 4 1 + 4 5 – + + 1 2 4 2 + 4 6 + + + 1 2 4 1 + 2 + 4 7 Konkrétně u ENTEROtestu16 (17 testů) (530 063 = E. coli, 99,89 %, Tin=1,00) 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 E 14 D 15 C 16 B 17 A První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l l l l l l l l l l l l l l l l – S l l l l l l l l l l l l l l l l ? S l l l l l l l l l l l l l l l l ? + – + + + – – – – – – – – + + + + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 5 3 0 0 6 3 Jiné identifikační testy nKromě testů založených přímo na štěpení substrátu, existují i jiné podobné testy, které zkoumají vybavení bakterií určitými enzymy či faktory virulence. Například: nTest schopnosti koagulovat králičí plasmu nTest schopnosti aglutinovat králičí plasmu nTest schopnosti „odpouzdřit“ opouzdřený kmen (hyaluronidázový test) Plasmakoaguláza a hyaluronidáza (oba testy se užívají u stafylokoků) P1020006a P1020006ax C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Z internetu\Medici\Stafylokoky\41 koaguláza.jpg www.hardydiagnostics.com Foto O. Z. Foto O. Z. Diagnostické použití antibiotik nJednou z možností je také testování in vitro citlivosti na určité antibiotikum v případě, že víme, že kmen X je ve 100 % citlivý a kmen Y je ve 100 % rezistentní. Ovšem ani tady těch „sto procent“ nebývá stoprocentních… nPříkladem je třeba optochinový test nPraktické provedení je stejné jako u testů citlivosti na antibiotika, které si probereme příště Optochinový test pozitivní a negativní C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Z internetu\Medici\Streptokoky\10 opto4a.jpg http://www.mc.maricopa.edu Nashledanou nPříště budeme pokračovat povídáním o antibiotikách Amoclen obrázek z intranetu FN u sv. Anny v Brně