Lumir Krejci! Laboratory of Recombination and DNA Repair Department of Biology &! National Centre for Biomolecular Research! Molekulární mechanismy opravy DNA aneb starejme se o svoji DNA, nevíme jak dlouho nám vydrží !!!!! Jaký mechanismus se podílí na opravě dvouřetězcových zlomů? Pojmy mutace - definice a principy typy genových mutací mutagen mechanismy opravy DNA - BER;NER; MMR onemocnění souvisejicí s opravou DNA epigentika Typy mutací Genomové (numerické aberace chromozomů)! Chromozomové (strukturní aberace chromozomů)! Euploidie! Aneuploidie! Genové (bodové) mutace! Poškození DNA - genové mutace Nečas a kol., 2000! Typy poškození DNA and spontánní změny Radiotherapy Ionizing Radiation X-rays Chemotherapy (Alkylating agents) Cisplatin Mitomycin C Cyclophosphamide Psoralen Melphalan UV (sunlight) Pollution (hydrocarbons) Vnější zdroje! Vnitřní zdroje Oxidative damage by free radicals (oxygen metabolism) Replicative errors Spontaneous alterations in DNA Alkylating agents Smoking Foodstuffs • ztráta báze – 26,000 • deaminace cytosinu – 1 000 • alkylace báze – x 10 000 • dimerizace pyrimidínů – 50 000 • ssDNA zlomy – 100,000 Celkem ~ 500 000 poškození/den/buňku Rozsah poškození DNA DNA Damage Exogenous Endogenous DNA Replication Permanent Genetic Alteration Disease Cell Cycle Arrest DNA Repair Apoptosis Rovnováha: poškození-oprava zdravá buňka! rychlost poškození = rychlost opravy" nemocná buňka! rychlost poškození > rychlost opravy" až 500.000 poškození DNA v buňce za den! vnější# poškození! vnitřní# poškození! oprava! oprava! poškozená DNA! poškozená DNA! apoptóza! rakovina! stárnutí! jaderná" DNA! mitochondriální" DNA! Mutace a rakovina V lidském těle za život – 1016 buněčných dělení V prostředí bez mutagenů 10-6 pravděpodobnost vzniku mutace na buněčné dělení a gen, takže za život 1010 mutací na každý gen Výskyt rakoviny jako funkce věku © Espero Publishing, s.r.o. !!! 1 mutace nestačí; většina mutací je opravena !!! 1. Direct reversals 2. Excision repair - Base Excision Repair (BER) - Nucleotide Excision Repair (NER) 3. Mismatch repair (MMR) - replication errors 4. Recombinational repair (HR and NHEJ) - multiple pathways - double strand breaks and interstrand cross-links 5. Tolerance mechanisms - lesion bypass (TLS) - recombination! DNA Repair Pathways T T Visible light T T Oprava přímou přeměnou - fotoreaktivace 1)  Rozeznání a přímá oprava chybného místa (rozpoznává pyrimidinové dimery) 1)  Rozeznání a odstranění chybného místa 2)  Vyplnění mezery 3)  Spojení řetězce DNA Body 2-3 téměř stejné u různých typů oprav, v bodu 1 jsou u různých oprav zúčastněny různé proteiny Base Excision Repair (BER) Oprava deaminace, oxidativní a jiné malé poškození báze Nucleotide Excision Repair 1.  Rozpoznání proteinovými faktory 2.  Vystřižení postiženého místa i s okolím v obou směrech (nukleáza). 3.  Rozmotání DNA – bublina (DNA-helikáza) 4. Syntéza na základě komplementárního vlákna (DNA polymeráza δ a ε) 5. Spojení DNA ligázou Oprava dimerů, croslinkované DNA a dalších látek narušujících helix CSA & CSB - XPC not required Nucleotide Excision Repair E. coli 5’ incision is 8 nuc. from lesion 3’ incision is 4 nuc. from lesion Mammals 5’ incision is 22 nuc. from lesion 3’ incision is 6 nuc. from lesion Cockayne’s Syndrome • Occurrence: 1 per million population • Genetic: autosomal recessive, genes (XPA, B, D & G) • Disorder: arrested development, mental retardation, dwarfism, deafness, optic atrophy, intracranial calcifications; (no increased risk of cancer) Poruchy NER u lidí Trichothiodystrophy • Occurrence: 1-2 per million population • Genetic: autosomal recessive, (TTDA, XPB a D) • Disorder: sulfur deficient brittle hair, mental and growth retardation, peculiar face with receding chin, ichthyosis; (no increased cancer risk) Xeroderma Pigmentosum • Occurrence: 1-4 per million population • Genetic: autosomal recessive, seven genes (XPA-G) • Disorder: multiple skin disorders; malignancies of the skin; neurological and ocular abnormalities Mechanismus pro zajištění přesnosti replikace 1. Párování bází 10-1 to 10-2 2. DNA polymerázy 10-5 to 10-6 - selekce báze - autokorekce 3. Další proteiny 10-7 4. Oprava chybného párování 10-10 Further reading: A. Bellacosa, Cell Death and Differentiation 8, 1076 (2001) M. J. Schofield & P. Hsieh, Ann. Rev. Microbiol. 57, 579 (2003) Oprava chybného párování (Mismatch Repair) 1)  MutS protein nasedá s MutL na špatně zařazenou bázi 2)  Aktivace MutH, který vytvoří zlom v nově vznikajícím řetězci. 3)  Takto „označený“ řetězec je vyštěpen exonukleázou, resyntetizován DNA polymerázou a spojen DNA ligázou. Mismatch Repair Mismatch Repair Mutace v genech pro Mismatch Repair a Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer (HNPCC) •  Mutace v MMR u 70% rodin •  MLH1 (50%), MSH2 (40%) •  Minoritní role pro MSH6, PMS1, PMS2 •  Výskyt v populaci 1:2851 (15-74 let) •  18% případů pod 45 let •  28% případů pod 30 let Typ poškození: 1.  Dvouřetězcové zlomy 2.  Interstrandové cross-linky Recombinační DNA oprava Vznik: • Indukované radiací & chamikáliemi • Během replikace poškozené DNA • Slouží k iniciaci meiotické rekombinaci • Součást imunitní odpovědi Neschopnost opravy: • Buněčná smrt • Chromosomální aberace • Meiotická aneuploidie • Immuno-deficience Dvouřetězcové zlomy v DNA Adapted from Surralles et al., Genes Dev. (2004) Pol eta - inserts adenosines opposite TT dimers - in general has low fidelity - low processivity - may be error-prone with other lesions - Pol eta is a product of the XPV gene Pol zeta and Rev 1 - Rev 1 inserts random bases opposite dimer - Pol zeta extends bypass by a few bases - Both polymerases have low fidelity and low processivity Translézní DNA Polymerázy Cross-link repair Model for the mechanism of DNA ICL repair in mammalian cells. Rekombinace Translesion bypass Model opravy ICL (Interstrand CrossLinks) NER + FA Core Complex FancD2-Ub Brca2 Rad51, etc. Nová MMR! NER/HR! Richard D. Kennedy et al. Genes Dev. 2005; 19: 2925-2940 Schematic interaction of the FA pathway L=catalytic element? =BRIP1 and BRCA1, RAD51, PCNA, NBS1 Fanconi’s Anemia Congenital abnormalities - skeletal - skin pigmentation - short stature - male genital - mental retardation - cardiac abnormalities - hearing Cancer - myeloid leukemia - solid tumors Review: Tischkowitz & Hodgson, J. Med. Genet. 40, 1 (2003) 15 genes in FA BRCA2 is deficient in FA-D1 Dráha Error-free Error-prone Přímá přeměna + NER + BER + HR + SSA + NHEJ + MMR + Lesion bypass + + Souhrn DNA oprav Epigenetika – mitoticky a meioticky děděné změny genové exprese, ke kterým dochází beze změny primární genetické informace – strukturní a chemické modifikace chromatinu. Modifikace DNA – adice chemických skupin – metylace cytosinu- inaktivace Modifikace histonů – acetylace a metylace Epigenetika a rakovina Celková hypometylace DNA – jev provázející nádorovou chromozomální nestabilitu, oncogeny Hypermetylace DNA a hypoacetylace chromatinu tumorsupresorových genů (RB1) – nádorová transformace Poruchy parentálního imprintingu – aktivace spící alely nebo inaktivace normálně funkční alely Mutace and rakovina Epigenetika a rakovina – epigenetický progenitorový model rakoviny Rakovina vzniká ve 3 krocích: 1) epigenetické alterace kmenových nebo progenitorových buněk 2) iniciační mutace v tumor supresorovém genu nebo onkogenu, 3) genetická a epigenetická nestabilita Seong et al. J. Biol. Chem., 2008! Helikázová aktivita 0                      5                  10              25                50              100            200            400          nM  Srs2  3’   30°C    10’   Protein modification by SUMOylation Proteinové interakce (Krejci et al, Nature 2003) Krejci et al. NATURE, 2003! (Krejci et al, Nature 2003)Krejci et al. NATURE, 2003! (U. of Copenhagen): Michael Lisby (MSKCC): Xiaolan Zhao (COLUMBIA): Rodney Rothstein (YALE): Patrick Sung (WUSTL): Tom Ellenberger (UC DAVIS): Neil Hunter (U. Zurich): Pavel Janscak Děkuji za pozornost