1 Možnosti molekulární diagnostiky v klinické praxi 2013 2 1. V kterém roce byla získána Nobelova cena za objev PCR? 3 2. Jaké je celé jméno nositele Nobelovy ceny za příspěvek k zavedení transplantace hematopoetických buněk do klinické medicíny? 4 Obsah Co nabízí molekulární diagnostika Stádium civilizačních chorob Jaké metody a jaké molekulární markery jsou dnes využívány v onkologické praxi Jakou informaci molekulární diagnostika poskytuje dnes Jakou informaci bychom chtěli získat zítra (jestli to dokážeme) 5 Diagnostika Morfologická (cytologie, histologie, cytochemie) Imunologická (IF, průtoková cytometrie) Cytogenetická (početní a strukturní změny) Molekulárně cytogenetická (FISH, CGH) Molekulárně genetická 6 Senzitivita diagnostických metod (CML) Metoda Target Tkáň Senzitivita Cytogenetika Ph BM 1%-10% FISH spojení Bcr a Abl PB/BM 0,2%-5% Southern M-BCR PB/BM 1%-10% Western Bcr-Abl protein PB/BM 0,2%-1% genetické změny zahrnující 106 - 107 bp se mohou projevit bez viditelné změny morfologie chromozomu (n)PCR BCR-ABL mRNA PB/BM -0,00001% RQ-PCR BCR-ABL mRNA PB/BM 0,001%-0,0001% 7 8 9 Who (really) discovered the structure of DNA? In April of 1953, James Watson, Francis Crick and Maurice Wilkins identified the substance of life - the structure of DNA. They later shared a Nobel Prize. Their discovery depended heavily on the work of a woman, chemist Rosalind Franklin, whose research was used without her knowledge or permission. Watson's memoir of the discovery dismisses Franklin as frumpy, hostile and unimaginative. A later work by a friend casts Franklin as a feminist icon, cheated of recognition. It was Franklin's photograph of the DNA molecule that sparked a scientific revolution. Wilkins showed Watson the photo, Watson said, "My jaw fell open and my pulse began to race „ The photo showed, for the first time, the essential structure of DNA - the double-helix shape, which also indicated its method of replication. Rosalind Elsie Franklin (1920-1958) 10 Nobel Prize in physiology/medicine in 1962 Maurice Hugh Frederick WilkinsFrancis Harry Compton Crick James Dewey Watson *1928 1916-2004 (+88) 1916-2004 (+87) 11 Najdete dva rozdíly? Crick má světlý oblek a nemá kravatu 12 Molekulární diagnostika DNA změny vrozené (vrozené genetické choroby - monogenní onemocnění, chromozomální poruchy, multifaktoriální poruchy) DNA změny získané - onkologie DNA cizorodá - diagnostika patogenů 13 Molekulární diagnostika v klinice Detekce přenašečů patologické alely Prenatální diagnostika Stanovení genetického rizika Včasné stanovení diagnózy Včasné stanovení oportunních patogenů Diferenciální diagnostika Stratifikace podle rizika Minimální reziduální choroba Včasná detekce relapsu choroby Specificita a senzitivita, rychlost získání výsledku a možnost správné a rychlé terapeutické intervence 14 Proč budeme mluvit hlavně o onkologii? 15 Podle klasické Omranovy teorie z roku 1971 všechny společnosti procházejí třemi stádii souvisejícími s procesem modernizace: 1.Stadium moru a hladomoru 2.Stadium poklesu frekvence výskytu pandemií infekčních nemocí 3.Stadium rozvoje degenerativních a civilizačních chorob (novotvary a nemoci oběhové soustavy) Omran, A.R.: The epidemiologic transition: a theory of the epidemiology of population change. Milbank memorial Fund Quaterly, 1971, 29 16 EU 15 nemoci oběhového systému 35% zhoubné novotvary 28% vnější příčiny 6% nem. dýchací 8% infekce 1% nemoci trávicí 5% jiné 17% Ostatní 37% ČR Ostatní 23% jiné 7% nemoci trávicí 4% infekce 0% nem. dýchací 4% vnější příčiny 7% zhoubné novotvary 27% nemoci oběhového systému 51% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 1970 1972 1974 1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 kardiovaskulární zhoubné novotvary vnější příčiny ostatní EU 15 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 1970 1972 1974 1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 kardiovaskulární zhoubné novotvary vnější příčiny ostatní ČR 17 Zemřelí podle vybraných skupin příčin smrti a věku, ČR, 2005 Demografický informační portál ČR 18 Původ hematoonkologických onemocnění systémová klonální onemocnění, vznik neregulovaným dělením jediné nádorově transformované buňky nižší počet genetických změn nutných pro vznik, někdy stačí narušení kontroly buněčného dělení změna zahrnující cca 10 6-10 7 bp se může projevit bez viditelné změny morfologie chromozomu 19 Dělení hematoonkologických onemocnění A) Podle charakteru difúzní (leukémie) ložisková (lymfomy) - s nádorovými ložisky v lymfatické tkáni B) Podle postižené krevní vývojové řady myeloidní prekurzorová buňka (CML, AML) -nádorová choroba vlastního krvetvorného systému lymfoidní prekurzorová buňka (CLL, ALL, lymfomy) -nádorová onemocnění imunitního systému 20 Dělení hematoonkologických onemocnění akutní leukémie (rychle probíhající, jsou neschopné vývoje v plnohodnotnou buňku, mají blok a ztrátu diferenciace) chronické leukémie (pomalu probíhající, mohou diferencovat v dospělé buňky, ale je u nich postižena apoptóza - přirozeně neumírají). 21 Incidence leukémií na 100 000 lidí/1 rok (evropská standardní populace) • CML • AML, APL • ALL • CLL • MDS • CMPD 1-2 ~3 ~1 3-4 ~3 2-4 22 Protinádorová terapie • Chemoterapie (léčiva s cytotoxickým účinkem) • Transplantace hematopoetických progenitorů • Hormonální léčba (nádory odvozené od hormonálně dependentní tkáně) • Diferenciační léčba retinoidy (stimulace diferenciace maligní buňky) • Bioterapie (hemopoetické růstové faktory, interferony a další cytokiny) • Radioterapie • Biologická léčba (MCA) • Inhibitory konstitutivně aktivovaných tyrozinkináz 23 24 Molekulárně biologické vyšetření oportunních patogenů IHOK FN BRNO •HHV-6,-7 •HSV-1,-2 •EBV, VZV •BK virus, JC virus •Respirační viry (RSV, PIV1-3, ADV1-7, Flu-A,-B) •Adenoviry •CMV a detekce mutací •Pneumocystis jirovecii •Mykózy Aspergillus fumigatus miluje teplo. Optimálně roste při 37C (tělní teplota). 25 Máme dostatečně kvalitní metody? 26 Metody molekulární diagnostiky 1.PCR 2.PCR 3.PCR 27 1983 K. Mullis 1985 publikace 1993 Nobelova cena za chemii PTC200 (MJR,USA, 250000 Kč) 1993 28 1st cycle 22=4 copies 35th cycle 2 36 = 68 billion copies 29 TaqDNA Polymerase, 1989 Brock TD and Freeze H (1969). "Thermus aquaticus, a Nonsporulating Extreme Thermophile". J. Bact. 98 (1): 289– 297. 30 Jaké jsou praktické aplikace PCR v klinické praxi ? 31 Jednokolová PCR Diagnostické vstupní vyšetření 32 33 Multiplex-PCR Dvoukolová nested-PCR 34 35 1 2 3 4 5 6 pacient kompetitor Kvantitativní kompetitorová PCR 1 2 3 4 5 6 pacient kompetitor 36 1: Biotechnology (N Y). 1992 Apr;10(4):413-7. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. Roche Molecular Systems, Inc., Emeryville, CA 94608. We have enhanced the polymerase chain reaction (PCR) such that specific DNA sequences can be detected without opening the reaction tube. This enhancement requires the addition of ethidium bromide (EtBr) to a PCR. Since the fluorescence of EtBr increases in the presence of double-stranded (ds) DNA an increase in fluorescence in such a PCR indicates a positive amplification, which can be easily monitored externally. In fact, amplification can be continuously monitored in order to follow its progress. The ability to simultaneously amplify specific DNA sequences and detect the product of the amplification both simplifies and improves PCR and may facilitate its automation and more widespread use in the clinic or in other situations requiring high sample throughput. 1: Biotechnology (N Y). 1993 Sep;11(9):1026-30. Related Articles, Links Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Roche Molecular Systems, Inc., Alameda, CA 94501. We describe a simple, quantitative assay for any amplifiable DNA sequence that uses a video camera to monitor multiple polymerase chain reactions (PCRs) simultaneously over the course of thermocycling. The video camera detects the accumulation of double-stranded DNA (dsDNA) in each PCR using the increase in the fluorescence of ethidium bromide (EtBr) that results from its binding duplex DNA. The kinetics of fluorescence accumulation during thermocycling are directly related to the starting number of DNA copies. The fewer cycles necessary to produce a detectable fluorescence, the greater the number of target sequences. Results obtained with this approach indicate that a kinetic approach to PCR analysis can quantitate DNA sensitively, selectively and over a large dynamic range. This approach also provides a means of determining the effect of different reaction conditions on the efficacy of the amplification and so can provide insight into fundamental PCR processes. 1: Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11;21(16):3761-6. Related Articles, Links Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Lee LG, Connell CR, Bloch W. Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer, Foster City, CA 94404. Nick-translation PCR was performed with fluorogenic probes. Two probes were used: one complementary to a sequence containing the F508 codon of the normal human cystic fibrosis (CF) gene (wt DNA) and one complementary to a sequence containing the delta F508 three base pair deletion (mut DNA). Each probe contained a unique and spectrally resolvable fluorescent indicator dye at the 5' end and a common quencher dye attached to the seventh nucleotide from the 5' end. The F508/delta F508 site was located between the indicator and quencher. The probes were added at the start of a PCR containing mut DNA, wt DNA or heterozygous DNA and were degraded during thermal cycling. Although both probes were degraded, each probe generated fluorescence from its indicator dye only when the sequence between the indicator and quencher dyes was perfectly complementary to target. The identify of the target DNA could be determined from the post-PCR fluorescence emission spectrum. ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer/ABI) první dostupný RQ-PCR systém s laserem /1996 Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals) extrémní rychlost, kapiláry 5700SDS (Perkin Elmer/ABI) halogen, CCD /1998 … Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) 37 LightCycler (Roche) ABI7900HT (Applied Biosystems) 7300 System (Applied Biosystems) RotorGene 3000 (CorbettResearch,QIAGENE) RotorGene 6000 (CorbettResearch, QIAGENE) 38 Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) a) Interkalační barviva b) Hybridizační jednoduše značené sondy c) Hydrolyzační duálně značené sondy 39 TaqMan probes 40 41 42 43 44 45 46 Chronická myeloidní leukémie 47 Chronická myeloidní leukémie • Incidence 1.09 / 100 000 / rok (Evropská standardní populace) •Chronická fáze, akcelerovaná fáze, blastický zvrat • 95% pacientů s typickým molekulárním markerem BCR-ABL • pomalu probíhající, leukemické buňky mohou dále diferencovat •porucha apoptózy 48 John Hughes Bennett,Edinburgh 184518451845 Rudolf Virchow,Berlin 49 P.C. Nowell, D.A.Hungerford, University of Pennsylvania in Philadelphia 196019601960 50 Janet D. Rowley : A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature, 243, 290-293, 1973 1998 Albert Lasker Clinical Medicine Research Prize, 1999 National Medal of Science at a White House, 2003 Mendel Medal Villanova University *1925, University of Chicago 197319731973 51 Chronická myeloidní leukémie-CML 1845 první dokumentovaný klinický popis choroby 1960 publikace Ph chromozomu u CML pacientů 1970 izolace nového myšího onkogenního viru Abelson 1973 odhalení reciproké translokace t(9;22) jako příčiny Ph chromozomu 1980-1983 klonování v-Abl onkogenu, c-Abl protoonkogenu, jeho lokalizace na chromozomu 9 a demonstrace, že Abl kóduje protein-tyrozin kinázu 1986 klonování BCR-ABL cDNA z CML buněk 1996 imatinib mesylate inhibuje BCR-ABL tyrozin kinázu a CML buněčný růst in vitro 2001 imatinib (Glivec) jako selektivní inhibitor je potvrzen v terapii CML 2006 dasatinib (Sprycel) 2007 nilotinib (Tasigna) 115 15 5 52 Protinádorová terapie • Chemoterapie (léčiva s cytotoxickým účinkem) • Transplantace hematopoetických progenitorů • Hormonální léčba (nádory odvozené od hormonálně dependentní tkáně) • Diferenciační léčba retinoidy (stimulace diferenciace maligní buňky) • Bioterapie (hemopoetické růstové faktory, interferony a další cytokiny) • Radioterapie • Biologická léčba (MCA) • Inhibitory konstitutivně aktivovaných tyrozinkináz 53 Edward Donnall Thomas (1920-2012) 54 In the face of a skeptical medical community, Dr. Edward Donnall Thomas began infusing patients with donor bone marrow in 1955. 55 56 In the fall of 1955, Thomas and colleagues began infusing patients with donor bone marrow harvested from fetal and adult cadavers, from ribs removed at surgery and from hipbones using an aspiration needle. The collected marrow was passed repeatedly through a stainless-steel screen and broken into a smooth cellular suspension. Fat was removed using centrifugation. The marrow cells were suspended in tissue-culture fluid and serum. Unused cells were frozen in glycerol and stored at -80 C. J Clin Invest 1959; 1709-1716 57 1958 On October 7 the marrow donor was taken and under general anesthesia 25 marrow aspirations were performed on the sternum, tibiae and anterior and posterior iliac crests. This marrow was transferred immediately to Hanks' solution containing heparin and passed through stainless steel screens. The marrow was frozen in 15% glycerol and stored at – 80oC. On October 12 this marrow was thawed, deglycerolized and administered to the irradiated recipient 3-year-old girl with endstage leukemia. This time, a large dose of radiation and marrow from twin resulted in a successful transplant. The patient did well for six months until her leukemia returned. J Clin Invest 1959; 1709-1716 58 DOGS AROUND THE WORLD ARE HAPPY ABOUT THE NEWS! Stem Cells Now Curing Dogs of Leukemia WSU to offer bone marrow transplants to sick pets It's a big 'give-back' to dogs for cancer help The bone marrow or stem cell transplant, a procedure that every year saves tens of thousands of lives and won for the Seattle physician who pioneered it the 1990 Nobel Prize in Medicine, appears poised to come full circle and finally become more widely available to those who first made it all possible.The WSU transplant program, which will be a partnership with a private business based in North Carolina, is intended to make the procedures available to pet owners for about $15,000 to $20,000 per dog. Dogs suffering from lymphoma will be able to receive the same type of medical treatment as their human counterparts, as North Carolina State University becomes the first university in the nation to offer canine bone marrow transplants in a clinical setting. Dr. Steven Suter, assistant professor of oncology in NC State's College of Veterinary Medicine, received three leukophoresis machines donated by the Mayo Clinic in Rochester, Minn. Leukophoresis machines are designed to harvest healthy stem cells from cancer patients. The machines, once used for human patients, are suitable for canine use without modification, as bone marrow therapy protocols for people were originally developed using dogs. 2008 • Chimérizmus • výjimečný imunologický jev, kdy buňky z geneticky rozdílných jedinců spoluexistují v jednom těle • Kompletní dárcovský buněčný chimérizmus (donor chimerism, DC) • pokud původní krvetvorba příjemce je kompletně nahrazena dárcovskou krvetvorbou získanou a rozvinutou na základě aktivity přijatého štěpu obvykle spojený s nízkým rizikem relapsu a lepší prognózou • Smíšený chimérizmus (mixed chimerism, MC) • původní krvetvorba příjemce v lymfohematopoetických tkáních koexistuje s krvetvorbou dárce • přetrvávání příjemcovy hematopoézy zesiluje riziko relapsu, • Autologní obnova • Polymorfismy VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) nebo STR (short tandem repeats ) • polymorfismus mezi dárcem a příjemcem, tzn. znaku jedinečného pro příjemce. Nalezení takového markeru je nezbytné k určení podílu krvetvorby dárce a příjemce po alogenní transplantaci krvetvorných buněk. K analýze pomocí RQ-PCR využíváme existence polymorfismů typu inserce/delece (in/del) • hodnocení úspěšnosti transplantace, upozorňuje na počátek nové expanze patologického klonu 60 Fragmentační analýza fragmenty DNA syntetizované PCR s fluorescenčně značeným primerem v automatickém analyzátoru jsou jednotlivé DNA fragmenty ve velmi tenké kapiláře,naplněné polymerem na bázi PAA, rozděleny dle jejich velikosti a náboje a postupně detekovány laserovým detektorem v průběhu jediného běhu pak můžeme současně analyzovat několik různých fragmentů za předpokladu, že se navzájem liší svou délkou nebo jsou označeny různými fluorescenčními barvami. Spolu s každým vzorkem běží interní délkový standard, který umožní přesné určení délky jednotlivých fragmentů. 61 Detekce buněčného chimérizmu po HSCT 62 Hematologický relaps-příklad monitorování pacientů po HSCT R 154 dní RQ-PCR FA 63 Protinádorová terapie • Chemoterapie (léčiva s cytotoxickým účinkem) • Transplantace hematopoetických progenitorů • Hormonální léčba (nádory odvozené od hormonálně dependentní tkáně) • Diferenciační léčba retinoidy (stimulace diferenciace maligní buňky) • Bioterapie (hemopoetické růstové faktory, interferony a další cytokiny) • Radioterapie • Biologická léčba (MCA) • Inhibitory konstitutivně aktivovaných tyrozinkináz 64 The BCR-ABL fusion protein binds adenosine triphosphate (ATP) and transfers phosphate to tyrosine residues on its substrate, leading to transmission of intracellular signals that promote unregulated cell proliferation and anti-apoptotic effects and alter cell adhesion. Imatinib blocks the ATP binding site. Imatinib mesylate (STI 571) 65 66 67 c-kit receptor 68 Mechanismus rezistence k TKIs Adapted from Martinelli et al., Haematologica (2008);2:8-12 TKI resistance (imatinib) Altered expression/activity of imatinib transporters (hOCT1, ABCB-1) BCR-ABL overexpression Src kinase overexpression BCR-ABL kinase domain mutations Leukemic stem cell resistance (activation of β-katenin pathway, loss of p14ARF) Rezistence je multifaktoriální proces 69 Mutace v kinázové doméně BCR-ABL • Frekvence výskytu mutací “rare“ mutace 85% Dle ApperleyJF, Lancet Oncol,2007,8:1018-1029 … Milojkovic D , Apperley J Clin Cancer Res 2009;15:7519-7527 71 Metody detekce mutací v KD BCR-ABL +Yes0.01Nanofluidic plattform ++Yes0.01Allele-specific oligonucleotide PCR +Yes0.01Polymerase colony assay +Yes1 – 0.01TaqMan-based RQ-PCR +Semi-quantitative0.2Fluorescence PCR and PNA clamping +Yes1.3-5Multiplex SNP and mass spectrometry +No5High Resolution Melting analysis +No5Double-gradient denaturing electrophoresis ++Semi-quantitative5Pyrosequencing ++No0.1 - 10D-HPLC +Yes5-10Subcloning and sequencing +++No15-25Direct sequencing AvailabilityQuantitativeSensitivity (%)Methods sensitivita 72 Počátky sekvenačních metod sahají do roku 1977, kdy byly téměř současně uvedeny dvě metody, Sangerova a Maxamova-Gilbertova. Sangerova metoda se během let ukázala jako efektivnější a až donedávna byla v laboratořích téměř výlučně používána. S pokrokem vědy se ale zvedají nároky i na sekvenační metody, zpracovávají se větší objemy dat a je třeba, aby sekvenace byla nejen přesná, ale i levná a rychlá. Proto se vedle klasické Sangerovy metody začínají objevovat „metody nové generace“ (metody pyrosekvenace od 1996, SOLiD, Solexa a další) Sekvenace DNA Frederick Sanger Sekvenace DNA • chemická (Maxamovo-Gilbertovo sekvenování) - fragmenty DNA terminálně značené pomocí 32P - vystaveny působení chemických činidel, štěpících specificky v určitém místě molekuly DNA • enzymová (Sangerovo sekvenování) - automatické sekvenování • První část - standardní PCR probíhá se dvěma primery v jedné reakci. V druhé části probíhá vlastní asymetrická PCR, kdy je v jedné reakci použit vždy jen jeden primer. Dochází tak k amplifikaci jen jednoho ze dvou řetězců. • V reakční směsi jsou spolu s dNTPs použity i jejich fluorescenčně značené analogy dideoxyribonukleozidtrifosfáty (ddNTPs) - koncové inhibitory elongace→různě dlouhé značené fragmenty DNA. • fluorescenčně značené produkty jsou následně elektroforeticky rozděleny v kapiláře a detekovány pomocí laserového detektoru. Laserem excitované fluorescenční fluorochromy emitují záření různých vlnových délek • Pořadí nukleotidů je automaticky odečítáno detektorem • Sekvence je následně komplexně analyzována speciálním softwarovým programem. 74 75 Screening of ABL kinase domain mutations RT-PCR: region ABL rearranged domain in BCR-ABL by Expand High Fidelity Enzyme (Roche) Primers: F-BCR-A (exon e12/e13) x R-ABL-A (exon a8) 5´-CTC TAG CAG CTC ATA CAC CTG GG-3´R-ABL-A 5´-GAG CAG CAG AAG AAG TGT TTC AGA-3´F-BCR-A* 5´-GCG CAA CAA GCC CAC TGT CTA TGG- 3´ABL-ALT* 5´ 3´Primer Gorre M.E. et al. 2001 Science*, Soverini S. et al. 2004 Clin.Chem.* Conventional direct sequencing: by using a BigDye®Terminator v1.1 Seq.kit /AbiPrism 310 System/, exon4-exon8, Primer: ABL-ALT Comparison with the GeneBank mRNA sequence X16416 76 22/9 PB T315I 32,60% 0% 32,6% 88,9% 77 Akutní myeloidní leukémie 78 Akutní myeloidní leukémie • Incidence 3 / 100 000 / rok (Evropská standardní populace) • heterogenní skupina onemocnění • získané chromozomální aberace v hematopoetických progenitorech • 40-50% případů AML s molekulárním markerem • prudká manifestace, porucha vyzrávání a porucha diferenciace 79 80 AML s rekurentními genetickými abnormalitami 1) AML s t(8;21)(q22;q22) gen RUNX1/RUNXT1 (AML1/ETO) 2) AML s inv(16)(p13.1q22) nebo t(16;16)(p13.1;q22) gen CBFB/MYH11 3) APL s t(15;17)(q22;q12) gen PML/RARa (bcr1, bcr2, bcr3) 4) Aberace genu MLL/* (*partneři AF4, AF6, AF9, ELL, ENL, …) Nespecifické prognostické markery 1) Mutace v genu NPM1 2) Mutace v genu CEBPA 3) Mutace v genu FLT3 (FLT3-ITD nebo FLT3-TKD) 4) Mutace v genu IDH1 a IDH2 5) Parciální tandemové duplikace v genu MLL (MLL-PTD) 81 Walter MJ et al. Next-generation sequencing of cancer genomes: back to the Future. Per Med. 2009 November 1; 6(6): 653. doi:10.2217/pme.09.52. 82 gen PML/RARa - typicky výskyt u akutní promyelocytární leukémie (APL) (dle FAB – AML M3) - t(15;17)(q22;q12) – detekována u více jak 99% všech APL - PML – Promyelocytic Leukemia gene - RARa – Retinoic Acid Receptor alpha gene - podle zlomu v genu PML rozlišujeme tři základní typy transkriptů - pro MRN je nutná specifikace zlomu Frekvence - 10% případů AML - prognóza – příznivá - dlouhá (L) forma (55% APL) - variantní (V) forma (5% APL) - krátká (S) forma (40% APL) 1 42 3 65 1 2 3 4 5 6 1 32 PML RARα 43 43 43 83 Protinádorová terapie • Chemoterapie (léčiva s cytotoxickým účinkem) • Transplantace hematopoetických progenitorů • Hormonální léčba (nádory odvozené od hormonálně dependentní tkáně) • Diferenciační léčba retinoidy (stimulace diferenciace maligní buňky) • Bioterapie (hemopoetické růstové faktory, interferony a další cytokiny) • Radioterapie • Biologická léčba (MCA) • Inhibitory konstitutivně aktivovaných tyrozinkináz 84 gen RUNX1/RUNX1T1 (AML1/ETO) - t(8;21)(q22;q22) - RUNX1 - Runt-Related Transcription Factor 1 (9 exonů) - RUNX1T1 – Runt-Related Transcription Factor 1; translated to 1 (13 exonů) Fúzní gen - typický je zlom za exonem 5 genu RUNX1 a před exonem 2 genu RUNX1T1 → protein obsahuje prvních 177 amk z RUNX1 a plnou délku RUNX1T1 proteinu Frekvence - 5% případů AML - typický výskyt u AML M2 (dle FAB) – až 40% AML M2 - prognóza – příznivá 85 gen CBFB/MYH11 - inv.(16)(p13.1q22) nebo méně často t(16;16)(p13.1;q22) - CBFB - Core Binding Factor b subunit gene - MYH11 – Myosin Heavy Chain 11 gene Frekvence 5-10% AML, subtyp AML M4, příznivá prognóza Fúzní gen - typy transkriptů podle místa zlomu v genu MYH11, nutná specifikace zlomu 85% pozitivních pacientů nese typ A 5% pacientů nese typ D nebo E, ostatní typy jsou sporadické CBFB MYH11 Typ A Typ D Typ E exon 10exon 9exon 8 exon 12exon 11 exon 13exon 7 exon 12 exon 13 exon 10exon 9exon 8 exon 12exon 11 exon 13 exon1 exon 5exon 4exon 3 exon1 exon 5exon 4exon 3 exon1 exon 5exon 4exon 3 86 gen MLL/* (ALL-1, HRX, HTRX) MLL – mixed lineage leukemia gene - lokalizace zlomu v 11q23 - jedním z mechanizmů iniciujících zlom je inhibice enzymu topoizomerázy II (primární a sekundární leukémie) - 37 exonů, protein 3969 AMK - tzv. promiskuitní gen – množství (80) potenciálních partnerů pro tvorbu FG - 87 Partneři genu MLL gen AF4 → MLL/AF4 t(4;11) – nejčastější translokace detekovaná u pacientů s ALL (3-8%) gen AF6 → MLL/AF6 t(6;11) gen AF9 → MLL/AF9 t(9;11) – 2% dospělých AML gen ENL → MLL/ENL t(11;19) gen ELL → MLL/ELL t(11;19) - prognóza – nepříznivá Detekce Diagnóza - multiplexová PCR reakce pro 6 nejčastějších fúzních genů - při pozitivitě sada samostatných PCR reakcí vždy s jednou sadou primerů pro konkrétní FG - pro ověření + identifikaci přesného zlomového místa - sekvenace Sledování MRN - míra exprese konkrétního FG je sledována metodou real-time PCR na úrovni mRNA (reverzní transkripce předchází RQ-PCR) 88 0 23 62 99 118 160 198 232 241 289 S1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 AML M2 s AML1/ETO (27 let) CYTOGENETIKA MYELOGRAM FLOWCYTOMET. I. 1.K 2.K RI 1.K3.K 252 %EXPRESE DNY DNY 0 23 62 99 118 160 198 232 241 289 %EXP.- BM 252 1,19 0,0013 0,001 0 0 0,008 0,39 0,97 0,015 %EXP.- PB 0,74 0 0 0,01 89 90 FLT 3 Gen - mutován až u 20-30 % NK-AML - lokalizace: 13q12 - velikost: 97,3 kb, 24 exonů Protein - 993 amk (112,8 kDa) - tyrozin kinázový receptor tř. III. - regulace hematopoézy Mutace - nejvýznamnější FLT3-ITD - in frame mutace (exon 14,15, velikost 3 až 400 bp) - bodové mutace (D385, exon 20) - převážně heterozygotní Prognóza: nepříznivá 91 FLT3 (FMS-like tyrosine kinase) STK1 (Stem cell kinase1) flk2 (Fetal liver kinase2) lokalizace 13q12 je členem rodiny receptorových tyrozinových kináz, exprimován na hematopoetických kmenových buňkách a také na buňkách leukemických. Mutace dvou typů popsány: 1) délkové v JM doméně (ITD, interní tandemové duplikace části genu) v exonu 14 (příp.15) 2) mutace v katalytické doméně TKD, kde kodóny D835 a I836 jsou kódovány nt GATATC, tvořící restrikční místo pro EcoRV (FLT3/D835) Mutace jsou detekovány u ~30% AML s normálním karyotypem, představují nepříznivou prognózu často jsou považovány za sekundární aberaci a nejsou stabilní v průběhu follow-up. FLT3/ITD FLT/D835 92 Detekce Záchyt - metodou PCR, vizualizace na 2 % agarózovém gelu exon 11 intron 11 exon 12 nativní FLT3 329 bp FLT3-ITD inzerce wt alela mut. alela 93 Midostaurin (PKC412A), N-benzoyl-staurosporine, potently inhibits protein kinase C alpha (PKC ), VEGFR2, KIT, PDGFR and FLT3 tyrosine kinases. Inhibuje tyrosinovou fosforylaci mutované alely FLT3/ITD i TKD mutace 94 •In humans, accumulating evidence that NPM is directly implicated in the pathogenesis of cancer •Over-expressed in solid tumors of diverse histological origin, is involved in tumor progression •In hematologic malignancies the locus NPM is lost or translocatted – formation of oncogenic fusion proteins •NPM gene contains 12 exons in maps to 5q35 •C-terminus contains a short aromatic stretch with two tryptophans at positions 288 and 290, which are crucial for NPM binding to the nucleolus (nucleolar localization signal) •Is more highly expressed in proliferating cells •Is involved in the apoptotic response to stress and oncogenic stimuli and can modulate the activity and stability of the oncosupressor protein p53 •Mutations are consistently heterozygous, are restricted to exon 12, except for 2 cases: exon 11(2007) and exon 9(2006), about 50 molecular variants of mutations to date in AML with >95% at nucleotide position 960 •Mutation A duplicates a TCTG tetranucleotide at positions 956 to 959 75-80% of adult NPMc+ AML cases Nucleophosmin (NPM1) Falini, NEJM, 2005 95Falini, B., et al., NEJM, 352, 254-266, 2005 96 The kinetics of changes of mutant signal in two representative patients with mutation A (A,B) and one patient with mutation B (C) during the clinical courses. The number of NPM1-mutated copies in bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) correlated with the treatment and disease status (I: induction chemotherapy; 1-, 2-, 3-C: first, second, and third consolidation chemotherapy; RI: reinduction chemotherapy; HR: hematological relapse, GE: genomic equivalent). 97 CEBPA Gen - mutace +/-10 % NK-AML - lokalizace: 19q13.1 - velikost: 2,38 kb, 1 exon Protein - 358 amk (42 kDa) - funkce - transkripční faktor - ovlivňuje diferenciaci granulocytů Mutace - mnohočetné mutace - převážně heterozygotní - lokalizované především na N konci - mutace x polymorfismus Prognóza: příznivá (?) 98 Detekce Záchyt - metodou High Resolution Melting Analysis CEBPA gene PP1 PP2 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4 50bp C1 C2 C3 C4 Reaction mixture C1-C4 • 5ul SensiMix HRM (Quantace, UK) • 0.4ul EvaGreen Dye (Quantace, UK) • 2x0.8ul specific primers (10uM)1 • 2ul distilled water • 1ul DNA template C1 1CEBPA primers (Pabst T. et al., Nature genetics 2001, Vol. 27, 263-270) HRM (high-resolution melting) • Měří rozdíl teplot tání mezi dsDNA se správně a chybně párovanými bazemi (polymorfismus nebo mutace) • Princip – snížení vzájemné afinity obou řetězců DNA způsobené mutací (vazby mezi řetězci mají nižší energii) – snadno oddělitelné působením tepelné energie • Screeningový test – typ variability stanovit sekvenováním 100 Chronic neutrophilic leukaemia Polycythaemia vera (1.08/100 000/rok) Primary myelofibrosis (0.37/100 000/rok) Essential thrombocythaemia (1.65/100 000/rok) Chronic eosinophilic leukaemia Mastocytosis Další myeloproliferativní neoplázie 101 The domains of JAK2 illustrating binding to the receptor and changes consequent to receptor binding and mutation in the JH2 domain. The V617F mutation of the JH2 domain of JAK2 results in constitutive kinase activation. Panel A: When no ligand in bound to the EPO, TPO, G-CSF or GM-CSF receptors, the kinase activity of the JH1 domain is inhibited by the JH2 domain and JAK2 is inactive. Panel B: When EPO binding to it receptor, the two strands of the receptor come closer together, JAK2 changes conformation, the JH1 kinase activity in no longer inhibited by JH2. Panel C: The JAK2 V617F mutation prevents JH2 from inhibiting JH1 and the kinase is active even when no ligand is bound by the receptor. Bennett and Stroncek Journal of Translational Medicine 2006 4:41 doi:10.1186/1479-5876- 4-41 102 gen JAK2 Rok 2005 období objevu mutací pracoviště D. Gary Gilliland (Boston), William Vainchenker (INSERM), Radek Skoda (Basel), Anthony Green (Cambridge) JAK2V617F (exon 14) 2006 Gary Gilliland skupina somatické mutace (exon 10) MPLW515L a MPLW515K u JAK2V617F negativních 5% PMF (primárních myelofibróz) a 1% ET 2007 A. Green další 4 mutace v JAK2 genu (exon 12, delece, inzerce) Clarifications on the precise pathogenetic role of these mutations as well as their importance as targets for small molecule therapy . 103 Detekce mutace V617F JAK-2 Metoda alelické diskriminace - separace granulocytů z PB - izolace gDNA - RQ – PCR s využitím fluorescenčně značených LNA modifikovaných hybridizačních sond (Locked Nucleic Acids) - vyznačují se 100% alelickou diskriminací obou genotypů - citlivost detekující 10% příměs granulocytů nesoucích mutantní alelu na pozadí zdravé populace - fluorescenční značení FAM pro sondu s WT sekvencí a JOE pro sondu s MUT sekvencí (Pekova, S. et al., Blood, 108, No 11, 313B, 2006 Veselovska et al. Leukemia Research, 32: 369, 2008) 104 Locked Nucleic Acid probes • Jde o sondy pro real-time PCR i klasickou • end-point PCR vyvinuté společností Proligo • jež jsou vhodné všude tam, kde je potřeba přesná kvantifikace nebo mutační diskriminace. • Ve srovnání s dosud používanými sondami • mají zvýšenou teplotní stabilitu a hybridizační specifitu. Umožňují proto snazší navrhování oligonukleotidových sond pro aplikace s problematickými cílovými sekvencemi 105 Alelická diskriminace pro detekci JAK2V617F primer F: 5´- GAAGCAGCAAGTATGATGAGCAA – 3 primer R: 5´- ACTGACACCTAGCTGTGATCC – 3´ JAK2 wt LNA sonda: FAM – tcCacAgaCaCatAc - BHQ1 JAK2V617F LNA sonda: HEX – ctcCacAgaAacAtaCtc – BHQ1 106 RQ – PCR analýza PacientPacient -- wtwt PacientPacient –– heterozygotheterozygot PacientPacient –– mutmut.. homozygothomozygot 107 Problematika sarkomů a karcinomů 108 In 1921, James Ewing, MD, described a bone tumor that, unlike the common bone tumor, osteosarcoma, could be treated with radiation. This newly identified tumor became known as Ewing’s tumor. At first, this tumor was only seen in bones. Soon, the same type of tumor was detected in the soft tissues and named extraosseous Ewing’s (EOE).A tumor is described by size, where it originated, and whether it has spread. This is called staging. A tumor of the Ewing’s family (TEF) is staged as either localized (involving only the site of origin and nearby tissues) or metastatic (involving spread to distant parts of the body). Ewingův sarkom a příklad diferenciální diagnostiky metodou PCR 109 Ewingův sarkom/PNET Alveolární rhabdomyosarkom Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) Druhý nejčastější primární maligní nádor kostí po osteosarkomu u starších dětí a mladých dospělých Diferenciální diagnostika založena na detekci transkriptů fúzních genů EWS/FLI-1, EWS/ERG, PAX3/FKHR, PAX7/FKHR, EWS/WT-1 110 Protinádorová terapie • Chemoterapie (léčiva s cytotoxickým účinkem) • Hormonální léčba (nádory odvozené od hormonálně dependentní tkáně) • Diferenciační léčba retinoidy (stimulace diferenciace maligní buňky) • Bioterapie (hemopoetické růstové faktory, interferony a další cytokiny) • Radioterapie • Inhibitory konstitutivně aktivovaných tyrozinkináz • Biologická léčba MCA 111 Tyrosine kinases are important mediators of the signaling cascade, determining key roles in diverse biological processes like growth, differentiation, metabolism and apoptosis in response to external and internal stimuli. Recent advances have implicated the role of tyrosine kinases in the pathophysiology of cancer. Though their activity is tightly regulated in normal cells, they may acquire transforming functions due to mutation(s), overexpression and autocrine paracrine stimulation, leading to malignancy. Constitutive oncogenic activation in cancer cells can be blocked by selective tyrosine kinase inhibitors and thus considered as a promising approach for innovative genome based therapeutics. The modes of oncogenic activation and the different approaches for tyrosine kinase inhibition, like small molecule inhibitors, monoclonal antibodies, heat shock proteins, immunoconjugates, antisense and peptide drugs are reviewed in light of the important molecules. 112 Receptor and nonreceptor tyrosine kinases (TKs) have emerged as clinically useful drug target molecules for treating certain types of cancer. Epidermal growth factor receptor (EGFR)-TK is a transmembrane receptor TK that is overexpressed or aberrantly activated in the most common solid tumors, including non-small cell lung cancer and cancers of the breast, prostate, and colon. Activation of the EGFR-TK enzyme results in autophosphorylation, which drives signal transduction pathways leading to tumor growth and malignant progression. Randomized clinical trials of the EGFR-TK inhibitor gefitinib have demonstrated clinical benefits in patients with advanced non-small cell lung cancer whose disease had previously progressed on platinum- and docetaxel-based chemotherapy regimens. 113 114 Inhibitory EGFR signalizace onctalk.com/2007/03/03/iressa-tarceva-hx-part-i/ 115 • Nemalobuněčný karcinom plic • NSCLC je civilizační choroba s vysokou incidencí a úmrtností, v ČR je každoročně diagnostikováno více než 6000 nových onemocnění. Přes vývoj nových léků a léčebných kombinací zůstává prognóza velmi špatná. • Kombinovaná chemoterapie, radioterapie a v posledních letech také biologicky cílenou léčbou. Náklady na konzervativní léčbu jsou značné, pravděpodobnost dosažení remise bývá menší než 50% a vedlejší účinky kombinované chemoterapie jsou často závažné. • V současnosti se nabízejí některé genetické prediktory umožňující individuální předpověď vhodnosti terapie pro konkrétního nemocného a je tak možno indikovat biologicky cílenou léčbu a ušetřit pacienty nežádoucích účinků cytostatik či předem predikovat neúčinnost chemoterapie - somatické mutace (EGFR a KRAS) a genové amplifikace (EGFR). 116 EGFR je povrchový receptor, jehož aktivací je spuštěna intracelulární signální kaskáda s vlivem na invazivitu, apoptózu a angiogenezi nádorového růstu. Zvýšená exprese EGFR u 40-80% NSCLC. Incidence aktivačních mutací EGFR u 10% (Evropa a Severní Amerika) až 40% (Východní Asie) NSCLC. Přítomnost mutací spojena s nekuřáctvím, ženským pohlavím, asijským původem a histologicky prokázaným adenokarcinomem a s lepším přežitím. KRAS mutace častější u kuřáků s NSCLC, u 20-30% NSCLC, rozporná data o účinnosti TK inhibice. Exon 21 117 118 119 120 Kolorektální karcinom (mCRC) rezistence na anti-EGFR terapii KRAS mutace • Aktivační mutace u 30-40% pacientů s CRC způsobuje rezistence na anti-EGFR terapii 97% mutací v exonu 2: kodón 12 (GGT) a 13 (GGC) • 30-50% pacientů bez odpovědi nemá mutaci KRAS; jiný mechanismus rezistence (geny BRAF, PIK3CA, KRAS – kodón 61, 146) BRAF mutace • Bodová mutace V600E (exon 15); 8-13 % u nemutovaných KRAS pacientů (KRAS a BRAF mutace se vyskytují současně výjimečně) 121 122 123 Postgenomická éra neboli období proteomiky znalost genomu umožní sestavit transkriptom a proteom rozvoj bioinformatiky identifikace proteinů, jejich orgánová a tkáňová lokalizace, interakce mezi proteiny, funkce možná pak pochopíme jak funguje buňka molekulární medicína individualizovaná medicína časová prodleva mezi možností diagnostikovat a terapeuticky zasáhnout 124 Hungerford D.A. et al. Chromosomes of three elephants, two Asian (Elephas maximus) and one African (Loxodonta africana). Cytogenetics. 1966;5(3):243-6. No abstract available.PMID: 5921502; UI: 67022018. Hungerford D.A., Snyder R.L., Chromosomes of the rock hyrax, Procavia capensis (Pallas), 1767. Experientia. 1969 Aug 15;25(8):870. No abstract available.PMID: 5348560; UI: 70027232. Goldman, J. et al.: Evolution of Management of CML, Tenth International Congress on Hematologic Malignancies 125 Next generation sequencing – High throughput sequencing Masivní paralelní sekvenování miliónů bází za minimální cenu sekvenace 126 Uveden na trh 2004. Uvolňování pyrofosfátových molekul z nukleotidů (emulzní PCR amplifikace DNA řetězců vázaných na stovky tisíc agarózových kuliček), produkce světla štěpením oxyluciferinu luciferázou. Roche(454) 2004 127 Uveden na trh 2006. Založen na konceptu „sequencing by synthesis“ (SBS) krátkých DNA fragmentů. Illumina (Bridge amplification) 2006 128 Applied Biosystems SOLid sequencer. Uveden na trh 2007. Sekvenace katalyzovaná DNA ligázou (Sequencing by Oligo Ligation and Detection) SOLid 2007 129 Mardis The impact of next-generation sequencing technology on genetics, Trends Genet., 2008, 24:133-41 130 Wheeler, et al. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. Nature, 452 (7189): 872-6, 2008 The association of genetic variation with disease and drug response have given great optimism for the impact „genomic medicine“. However, the formidable size of the diploid human genome, app. 6 gigabases has prevented the routine application. Here we report DNA sequence of a diploid genome of a single individual, James D. Watson, using massively parallel sequencing in picolitre-size vessels. We identified 3.3 million SNP, of which 10.654 cause amino-acid substitution within the coding sequence. 131 Watson si často nebere servítky a říká, co mu jazyk přinese. Jako učenci ze staré školy se mu hnusí politická korektnost, Watson vyjádřil pochyby, zda opravdu nutně musí být intelektuální kapacity všech lidí všude naprosto shodné, přičemž nepokrytě naznačil, že černí Homo sapiens v tomhle ohledu pokulhávají. Za to byl donucen odejít z vedení prestižní Cold Spring Harbor Laboratory. Celá kauza má poněkud pikantní dohru. Watsonův genom byl nedávno kompletně přečten a zveřejněn na internetu. Islandská genetická firma deCODE Genetics provedla analýzy Watsonova genomu a její experti došli k závěru, že Watson má 16krát více „afrických“ variant genů, než je u průměrného bělocha zvykem. „Takové množství afrických variant genů můžete očekávat u někoho, kdo měl za prapradědečka Afričana,“ interpretoval výsledky analýz Kari Stefansson z deCODE Genetics.October 2007 132 Bleeker, et al. Mutational profiling of cancer candidate genes in glioblastoma, melanome and pancreatic carcinoma reveals a snapshot of their genomic landscapes. Hum Mutat., 30 (2): E451-9, 2009 Exomic sequencing: evaluation for tumor-specific mutations in all exons of protein coding genes (i.e. sequencing only the protein coding regions or exons) Analysis of 18.191 well annotated coding sequences (RefSeq) in breast and colorectal cancers has led to the identification of somatic mutations in 1.718 genes. 280 of these have been denominated candidate cancer genes (CAN). 133 Torkamani and Schork, Prediction of Cancer Driver Mutations in Protein Kinases. Cancer Res, 68 (6): 1675-1682, 2008 A large number of somatic mutations accumulate during the tumorigenesis. A subset of these mutations contribute to tumor progression (know as „driver“ mutation) whereas the majority of these mutations are effectively neutral (know as „passenger“ mutations). We provide a ranked list of candidate driver mutations.Researchers can begin to distinguish the driver mutations that push cells towards cancer from passenger mutations that are a by-product of cancer cell development. 134 Roukos, Novel clinico-genome network modeling for revolutionizing genotype-phenotype-based personalized cancer care. Expert Rev Mol Diagn., 10 (1): 33-48, 2010 Cancer arise from changes in the DNA sequence in the genomes of cancer cells. All of these genetic alterations can now be discovered using next-generation DNA sequencing technology. This can achieve two major goals: first, to complete the catalogue of driver mutations, and second, to explore the functional role of cancer genes. 135 Mutace v genech IDH1 a IDH2 u AML 2009 136 Schematic representation of the molecular bases of myeloid neoplasms and hypothesized role of IDH1/IDH2 mutations. Haematologica. 2010 October; 95(10): 1623–1627. 137 2011 138 Tiacci E et al. Haematologica 2012;97:3-5 ©2012 by Ferrata Storti Foundation 2012 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152